Dokument: Impact and Regulatory Control of the CGP3 Prophage in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Impact and Regulatory Control of the CGP3 Prophage in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Einfluss und regulatorische Kontrolle des CGP3 Prophagen in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44174
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171121-141740-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pfeifer, Eugen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 271,80 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.11.2017 / geändert 16.11.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Almost all bacterial genomes contain substantial amounts of viral DNA, which may significantly impact microbial physiology. The spontaneous induction of prophages (SPI) has been reported as a common phenomenon of lysogenic bacterial strains and occurs even in the absence of an external trigger. By sacrificing a small fraction for the good of all, SPI was shown to promote the fitness of bacterial communities and to contribute to horizontal transfer of genetic information. Generally, it is considered that SPI is triggered by sporadic DNA damage activating the host’s SOS response. However, various examples demonstrated that also alternative pathways may cause the activation of prophages. One of them includes specific counteraction of xenogeneic silencers (XS). XS such as Lsr2 of Mycobacterium tuberculosis and H-NS of Escherichia coli are small nucleoid-associated proteins, which preferentially bind and silence AT-rich foreign DNA. Furthermore, it is suggested that XS mediate the stepwise acquisition of potentially useful genes and enable a mutual adaption of the host and the foreign element. In the present thesis, the SPI of CGP3, a cryptic prophage of the industrial relevant Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032, was investigated to examine prophage-host interactions, focusing on the impact of CGP3 on host physiology and the regulatory control of this element. In a first set of experiments, the dynamics of the SOS response and CGP3 induction were monitored by using promoter reporter fusions. Live-cell imaging of reporter strains in the microfluidic environment enabled to follow the fate of SOS and phage positive cells. This approach revealed that in ~63% of the cells an SOS response preceded prophage activation, whereas >30% of the cells displayed an SOS-independent CGP3 activation. SPI and CGP3 inducing experiments demonstrated that activation of CGP3 causes a growth arrest in all cells (or cell death), evincing that a small fraction of a C. glutamicum population is continuously lost due to SPI. This fitness burden was proven by a competitive growth experiment, where the prophage-free C. glutamicum strain MB001 showed a slight advantage in comparison to the wild type strain. Further on, comparative analysis revealed neither by phenotypic microarrays (>1100 conditions) nor by a long-term adaptive evolution experiment (>600 generations) significant disadvantages of strain MB001 regarding growth, genome stability and mutation frequencies. In previous studies, the prophage-encoded Lsr2-like protein CgpS was fished by a DNA affinity chromatography using an early phage promoter of CGP3. This work revealed that CgpS, in fact, inherits a crucial role as a silencer of cryptic prophage elements in C. glutamicum. In particular, ChAP-Seq experiments and transcriptome analysis confirmed the binding of CgpS to AT-rich DNA regions and repression of phage genes. Beside the similar mode of action and the XS-typical domain organization, CgpS can complement a Δhns phenotype in E. coli. Remarkably, bioinformatics analysis revealed that orthologues of CgpS/Lsr2 are present in several actinobacteriophages and occur even more likely in (predicted) temperate rather than in virulent phages. This finding emphasizes that XS-like systems may play important and so far overlooked roles in the interaction of bacteria and their phages. Besides maintaining a stable co-existence, they may also be exploited as weapon by phages in the arms-race of bacteria and phages. Bakterielle Genome sind praktisch übersät von viralen zum Teil kryptischen Elementen, welche die Physiologie von Bakterien maßgeblich beeinflussen können. Vor allem die spontane Aktivierung von viraler DNA (SPI), oder viral-ähnlichen Elementen, in lysogenen Bakterien ist ein fundamentales Phänomen, welches sogar unter nicht induzierenden Bedingungen auftritt. Durch SPI wird zum Wohle der gesamten Population ein kleiner Anteil der Population „geopfert“, was die Fitness von pathogenen oder Biofilm-bildenden Stämmen fördern kann und gleichzeitig auch zum horizontalen Transfer von genetischer Information beiträgt. Als Ursache für SPI werden spontan auftretende DNA Schäden, die zur Aktivierung der wirtsspezifischen SOS-Antwort führen, angenommen. Diverse Studien zeigten jedoch, dass auch alternative Signalwege die Prophagen aktivieren können. Einer dieser alternativen Wege basiert auf der Gegenwirkung von xenogenen silencer (XS) Proteinen. XS zu welchen Lsr2 aus Mycobacterium tuberculosis und H-NS aus Escherichia coli gehören, binden und reprimieren AT-reiche, fremde DNA Regionen. Interessenterweise können XS Proteine auch eine sukzessive Adaptation zwischen dem Wirt und dem extern angeeigneten Element ermöglichen. In dieser Arbeit wurde die SPI von CGP3, einem kryptischen Prophagen des industriell relevanten Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, untersucht, mit einem besonderen Fokus auf den Einfluss von CGP3 auf die Wirtsphysiologie und den molekularen Mechanismus hinter der Prophageninduktion. In ersten Experimenten wurde die Dynamik der SOS-Antwort und der Prophagenaktivierung mittels Promoterfusionen in Reporterstämmen quantitativ durch Durchflusszytometrie untersucht. Des Weiteren konnte durch Fluoreszenzmikroskopie in mikrofluidischen Systemen die weitere Entwicklung von SOS- und CGP3-induzierten Zellen verfolgt werden. Während in ~63% CGP3 durch die SOS-Antwort induziert wurde, erfolgte bemerkenswerterweise in >30% eine SOS-unabhängige Aktivierung. Sowohl in Untersuchungen zur SPI als auch unter induzierenden Bedingungen stoppten alle Zellen, in denen CGP3 aktiviert wurde, das Wachstum und zeigten somit, dass ein geringer Anteil einer C. glutamicum Population durch SPI ausgelesen wird. Dieser SPI-assoziierte Nachteil konnte in einem kompetitiven Wachstumsexperiment bestätigt werden, da der Wildtyp dem Prophagen-freien Stamm MB001 im Wachstum unterlag. Auch konnten weder in einer Hochdurchsatz-Vergleichsstudie (>1100 Bedingungen wurden getestet) noch in einem Langzeit-Evolutionsexperiment (>600 Generationen) signifikante Nachteile bezüglich Wachstum, Genomstabilität und Mutationshäufigkeiten für MB001 nachgewiesen werden. In vorangegangen Studien wurde CgpS, das CGP3-kodierte und Lsr2-ähnliche Protein, mit Hilfe eines frühen Phagenpromotors über eine DNA-Affinitätschromatographie gereinigt. In dieser Arbeit konnte die zentrale Rolle von CgpS als ein XS von kryptischen Prophagenelementen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte die bevorzugte Bindung an AT-reiche Regionen und die Repression von Phagengenen vor allem durch DNA-Bindestudien (ChAP-Seq, EMSA) und Transkriptomanalysen gezeigt werden. Neben einer klassischen XS-Domänenorganisation zeigte CgpS auch die Fähigkeit einen Δhns Phänotypen in E. coli zu komplementieren. Mittels bioinformatischer Analysen konnten zahlreiche Aktinobakteriophagen mit Orthologen von CgpS/Lsr2 identifiziert werden, die interessanterweise häufiger in vorhergesagten temperenten als in virulenten Phagen vorkommen. Diese Studie hebt besonders hervor, dass XS Systeme wichtige und bislang übersehene Funktionen in der Interaktion zwischen Bakterien und Phagen einnehmen. Neben der Erhaltung einer stabilen Koexistenz können sie somit auch als virale Waffe im Wettrüsten zwischen Bakterien und Phagen genutzt werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	21.11.2017
Dateien geändert am:	21.11.2017
Promotionsantrag am:	03.05.2017
Datum der Promotion:	31.08.2017