Dokument: Mutationen von STAT3 und NFKB1 in der Pathogenese von Autoimmun-Lymphoproliferativen Syndrom ähnlichen Erkrankungen

Titel:	Mutationen von STAT3 und NFKB1 in der Pathogenese von Autoimmun-Lymphoproliferativen Syndrom ähnlichen Erkrankungen
Weiterer Titel:	Mutations of NKFB1 and STAT3 in the pathogenesis of autoimmune lymphoproliferative syndrome like disorders
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44151
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171113-142755-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schipp, Cyrill [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.11.2017 / geändert 13.11.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Borkhardt, Arndt [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Das autoimmune lymphoproliferative Syndrom ist eine lymphoproliferative Erkrankung, die durch einen Defekt des FAS induzierten Apoptose Signalwegs ausgelöst wird. Die klassischen Symptome sind Lymphadenopathie, Hepatosplenomegalie, Autoimmunität und eine charakteristische Erhöhung von doppelt negativen T-Zellen (DNTs; TCRαβ+ CD3+ CD4- CD8-). Die meisten Patienten haben Mutationen in FAS, FASLG, oder CASP10. In ungefähr 20% aller Patienten ist die genetische Ursache bisher allerdings unklar. Zur Verbesserung der Diagnosestellung und zur Bereitstellung individueller Therapieoptionen ist jedoch eine genaue genetische Charakterisierung erforderlich. Um neue, krankheitsauslösende genetische Veränderungen in ALPS-Patienten zu finden haben wir eine Kohorte von 30 Kindern mit ALPS-ähnlichen Symptomen und unbekannter genetischer Ursache gesammelt. Die DNA der Patienten und ihrer Familien wurde mittels whole exome sequencing analysiert und auf krankheitsauslösende Veränderungen untersucht. Die so gefundenen Kandidaten wurden auf ihre Pathogenität untersucht. In den hier präsentierten Studien charakterisierten wir aktivierende Mutationen in signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) und trunkierende Mutationen in nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 (NFKB1). In zwei nicht verwandten Patienten mit ALPS-ähnlichen Symptomen haben wir zwei de novo Keimbahnmutationen in STAT3 gefunden (c.G833A, p.R278H; c.T1181C, p.M394T). In Luciferase-Reporter Experimenten zeigten die mutierten Proteine eine Hyperaktivierung in unstimulierten wie auch in IL-6 stimulierten Zellen. Dieses Ergebnis konnte durch den Nachweis von erhöhter STAT3 Phosphorylierung im Immunoblot und durch eine erhöhte Expression von STAT3 Zielgenen in qRT-PCR Experimenten bestätigt werden. Lymphozyten der Patienten waren resistent gegenüber verschiedenen apoptotischen Stimuli. Diese Resistenz konnte in Zellen mit der R278H Mutation durch den STAT3 Inhibitor S3I-201 überwunden werden. Weitere Analysen offenbarten ein gestörtes Verhältnis zwischen pro- und anti-apoptotischen Proteinen der BCL-2 Familie als Ursache der Apoptose Resistenz. Wir zeigten, dass Patientenzellen, die bedingt durch STAT3 Hyperaktivität BCL-2 überexprimieren, empfindlicher für Apoptose nach Behandlung mit dem BCL-2 Inhibitor ABT-737 im nanomolaren Bereich waren. Zusammenfassend konnten wir aktivierende Keimbahn STAT3 Mutationen als Auslöser ALPS ähnlicher Symptome durch Dysregulation der BCL-2 Proteinfamilie identifizieren. Betroffene Patienten könnten von einer Behandlung mit BCL-2 Inhibitoren profitieren. Zwei weitere nicht verwandte Patienten wiesen trunkierende Keimbahnmutationen in NFKB1 auf (c.A137del, p.I47YfsX2; c.C469T, p.R157X). Während die p.I47YfsX2 Mutation in der einen Patientin de novo auftrat, wurde die p.R157X Mutation in der anderen Familie vom Vater an die Patientin und zwei weitere Kinder vererbt. Bis auf diese Patientin sind die anderen Mutationsträger in der Familie jedoch gesund und weisen nur eine leichte subklinische Hypogammaglobulinämie auf. Beide Mutationen führten zur Haploinsuffizienz der Genprodukte p50 und p105. Als Folge waren viele Gene, die im kanonischen NF-κB Signalweg eine Rolle spielen schon im unstimulierten Zustand dysreguliert. Nach Stimulation des kanonischen NF-κB Signalwegs mit LPS, TNFα oder IL-1β zeigten Zellen beider Patienten ein anormales Verhalten. Auffallend war in beiden Patienten ein Abhanden sein von spezifischen Antikörpern und eine erfolglose Immunisierung nach Impfungen. Zusammenfassend konnten wir zeigen dass deletierende Mutationen in NFKB1 zu einem Phänotyp führen der mit ALPS überlappt. Diese Patienten hatten einen gestörten kanonischen NF-κB Signalweg und hatten eine spezifische Antikörper Defizienz. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine genetische Veränderung mit spezifischer Antikörper Defizienz in Zusammenhang gebracht werden. Zusammen betrachtet erweitert diese Studie die Vielfalt der genetischen Veränderungen in Patienten mit ALPS-ähnlichen Symptomen. Alle vier beschriebenen Patienten präsentierten sich unter anderem mit dem klassischen ALPS-Phänotyp, bestehend aus Lymphadenopathie, Hepatosplenomegalie, Autoimmunität und einer erhöhten Zahl von DNTs. Im zukünftigen Screening von ALPS-Patienten sollten die Gene STAT3 und NFKB1 eingeschlossen werden. Dadurch könnten zum einen Patienten mit aktivierenden STAT3 Mutationen mit dem BCL-2 Inhibitor ABT-199 behandelt werden. Zum anderen sollten Patienten mit trunkierenden NFKB1 Mutationen nicht mit NF-κB Inhibitoren behandelt werden. Dazu gehört Cyclosporin A, ein Mittel das gelegentlich zur Behandlung von Zytopenien in ALPS-Patienten angewandt wird. The autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS) is a lymphoproliferative disease caused by defects in FAS mediated apoptosis. Symptoms include lymphadenopathy, hepatosplenomegaly, autoimmunity and a characteristic increase of double negative T-cells (DNTs; TCRαβ+ CD3+ CD4- CD8-). Most patients harbor mutations in FAS, FASLG, or CASP10. However, in roughly 20% of patients no genetic lesion in these genes can be found. In order to improve diagnosis and to provide individualized therapeutic options, knowledge of the underlying genetic cause is essential. To identify novel disease causing mutations in ALPS patients we collected a cohort of 30 children with ALPS-like disease of unknown genetic cause. The DNA of patients and their families was analyzed employing whole exome sequencing. Candidate mutations were functionally validated with regard to their pathogenicity. In two unrelated patients with ALPS like symptoms we found two de novo germline mutations in STAT3 (c.G833A, p.R278H; c.T1181C, p.M394T). In luciferase reporter assays mutated proteins proved to be hyper-active both under baseline conditions and after IL-6 stimulation. This finding could be confirmed by immunoblot showing increased STAT3 phosphorylation and by upregulation of STAT3 target genes in qRT-PCR experiments. Patient derived lymphocytes showed resistance to various apoptotic stimuli that could be rescued in R278H mutated cells by treatment with the small molecule inhibitor of STAT3 S3I-201. Further analysis revealed that the apoptotic resistance was caused by a STAT3 mediated disruption of the balance between pro- and anti-apoptotic BCL-2 family proteins. We showed that compared to healthy controls application of the BCL-2 inhibitor ABT-737 in a nanomolar range was able to induce apoptosis significantly more effective in patient derived cells due to overexpression of BCL-2. Summarized we showed that activating germline mutations of STAT3 can mimic ALPS by dysregulating the balance of BCL-2 family proteins and can potentially be treated with BCL-2 inhibitors. Two other unrelated patients with ALPS like symptoms harbored truncating germline mutations in NFKB1 (c.A137del, p.I47YfsX2; c.C469T, p.R157X). While the p.I47YfsX2 mutation was acquired de novo in the patient, the p.R157X mutation was segregated from the father to the patient and two siblings. However, only the patient was symptomatic while the father and the siblings just had a mild subclinical hypogammaglobulinemia. Both mutations caused haploinsufficiency of the two gene products p50 and p105. This resulted in dysregulation of genes involved in the canonical NF-κB pathway under baseline conditions. Mutated cells also showed aberrant response to stimulation of the canonical NF-κB pathway with LPS, TNFα, or IL-1β. Strikingly, both patients lacked specific antibodies and did not show immunization after vaccination. Summarized we showed that deleterious mutations in NFKB1 can lead to a phenotype that partly overlaps with ALPS. Patients had disrupted canonical NF-κB signaling and were deficient for specific antibodies. For the first time specific antibody deficiency was linked to a genetic cause by this study. Taken together these studies extend the genetic variations found in patients with ALPS like disorders. All four patients presented, among other, with ALPS like symptoms including lymphadenopathy, hepatosplenomegaly, autoimmunity and elevated levels of DNTs. In the future screening for mutations in ALPS like patients should also include STAT3 and NFKB1. In patients with activating STAT3 mutations individualized therapeutic options may include the BCL-2 inhibitor ABT-199. In patients with deleterious NFKB1 mutations therapy should exclude NF κB inhibitors like cyclosporine A which is sometimes used to treat cytopenias in ALPS patients.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	13.11.2017
Dateien geändert am:	13.11.2017
Promotionsantrag am:	15.08.2017
Datum der Promotion:	26.10.2017