Dokument: Non-invasive detection and analysis of circulating nucleic acid biomarkers

Titel:	Non-invasive detection and analysis of circulating nucleic acid biomarkers
Weiterer Titel:	Nichtinvasive Detektion und Analyse zirkulierender zellfreier Nukleinsäure Biomarker
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43983
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190118-103933-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Nocon, Annette [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,67 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.10.2017 / geändert 22.10.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Weber, Andreas [Gutachter] Prof. Dr. Schulz, Wolfgang A. [Gutachter]
Stichwörter:	circulating cell-free nucleic acids, DNA extraction, automation, plasma, biomarker, cancer diagnostics, prenatal diagnostics
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Hintergrund Nukleinsäuren wurden bereits 1948 in menschlichem Blutplasma entdeckt, aber erst sehr viel später wurden die Forschungsarbeiten wiederaufgenommen und die Bedeutung für die Krebs- und Pränataldiagnostik, sowie weitere Anwendungsbereiche erkannt. So genannte zirkulierende, zellfreie Nukleinsäuren kommen in Blut und anderen Körperflüssigkeiten vor, aber ihr Ursprung ist immer noch umstritten. Aus diesem Grund wurden bislang unterschiedliche Quellen und Freisetzungsmechanismen von zirkulierenden, zellfreien Nukleinsäuren in die Blutzirkulation veröffentlicht. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften, ist ihr klinischer Einsatz als Werkzeug für eine Biopsie aus Flüssigkeit (hier: Plasma) oder als Biomarker im Allgemeinen eine große Herausforderung. Dabei müssen präanalytische, sowie analytische Abläufe nicht nur optimiert, sondern auch standardisiert werden, um eine zukünftige klinische Nutzung zu ermöglichen. Die wichtigsten Eigenschaften, die stets während meiner Dissertation berücksichtigt werden mussten, waren die starke Fragmentierung und die äußerst geringe Konzentration von zirkulierender zellfreier DNA in Plasma. Experimenteller Ansatz Nach der Etablierung optimaler präanalytischer Bedingungen, wurde eine neue automatisierte DNA-Extraktionsmethode auf einem bestehenden Gerät, dem QIAsymphony SP, entwickelt, um zirkulierende, zellfreie DNA anreichern zu können. Das QIAamp Circulating Nucleic Acid (=cNA) Kit wurde immer als manuelle Referenzmethode verwendet. Bei Verwendung des QIAsymphony circulating DNA (=cDNA) Protokolls sollte mindestens die gleiche DNA-Ausbeute erzielt werden. Die meisten Experimente wurden mit Plasma von gesunden Einzelspendern durchgeführt, aber um die zukünftige klinische Eignung zu bestätigen, musste auch die erfolgreiche Extraktion von DNA aus klinischen Patientenproben gezeigt werden. Dafür wurde fötale DNA aus maternalen Plasmaproben isoliert und Tumor-DNA wurde nach Verarbeitung von Plasmaproben, die von Krebspatienten stammen, gewonnen. Um zwischen männlicher fötaler, bzw. Tumor-DNA und normalem (maternalem/ gesundem) Hintergrund unterscheiden zu können, wurden ein Y-Chromosom spezifisches Gen, sowie bestimmte DNA-Mutationen nachgewiesen. Dabei sollte nicht nur die Anwendbarkeit für klinische Proben, sondern auch die Kompatibilität mit unterschiedlichsten Analysemethoden gezeigt werden. So wurden quantitative Real-time PCR, BEAMing als digitale PCR-Methode, Pyrosequenzierung, Qubit-Messungen, sowie Agilent virtuelle Gelelektrophorese und die gezielte Sequenzierung von bestimmten Genen durchgeführt. Ergebnisse Das neu entwickelte automatisierte Protokoll und das QIAamp cNA Kit waren vergleichbar. Obwohl die DNA-Ausbeute bei Verwendung der Referenzmethode für klinische Proben höher war, war der Anteil an fötaler und Tumor-DNA in den meisten Fällen vergleichbar. Wenn also ein DNA-Verlust für das neu entwickelte automatisierte Protokoll auftrat, wirkte sich dieser nicht spezifisch auf die Ziel-DNA (hier: fötale und Tumor-DNA), sondern in gleichem Maße auch auf den normalen DNA-Hintergrund aus. Bei Betrachtung der Ergebnisse nach virtueller Gelelektrophorese mittels Agilent, scheint sich die Größenverteilung innerhalb zirkulierender, zellfreier DNA zwischen gesunden Einzelspendern, maternalen Plasmaproben und Proben von Patienten mit Krebs und anderen Erkrankungen, kaum zu unterscheiden. Der Hauptteil war im Längenbereich von Mononukleosomen vertreten. Folglich gab es keinen offensichtlichen Längenunterschied von Plasma-DNA-Fragmenten aus Proben von Patienten oder gesunden Individuen. Schlussfolgerung Das neu entwickelte automatisierte Protokoll sollte für die geplante Standardisierung hilfreich sein, eine gute Grundlage für die Analyse bestehender und die Entdeckung neuer Biomarker liefern und möglicherweise den Fortschritt im Bereich zirkulierender, zellfreier Nukleinsäuren als nicht- bis minimal invasives diagnostisches und/ oder prognostisches Werkzeug, bzw. Hilfsmittel fördern. Background Nucleic acids in human blood plasma were discovered in 1948, but it took a long time until research resumed and the meaning for cancer and prenatal diagnostics as well as further application fields became apparent. So-called circulating cell-free nucleic acids (=ccfNA) are present in blood and other body fluids, but their origin is still controversially discussed. To that effect, different sources and release mechanisms into blood circulation have been published to date. According to their specific characteristics, the integration of circulating cell-free DNA (=ccfDNA) as a tool for “liquid biopsy” or a biomarker in general into clinical practice is very challenging. Therefore, preanalytical as well as analytical procedures not only have to be optimized, but also standardized for possible future clinical use. The most important characteristics, which still had to be considered during this PhD thesis, were the strong fragmentation and very low concentration of ccfDNA in plasma. Experimental approach After the establishment of optimal preanalytical conditions, a new automated DNA extraction method for the enrichment of ccfDNA was developed on the QIAsymphony SP instrument. The QIAamp Circulating Nucleic Acid (=cNA) Kit was always used as manual reference method. Using the QIAsymphony circulating DNA (=cDNA) Protocol at least the same DNA recovery should be achieved. Most experiments were performed with plasma of healthy donors, but, as a tool for clinical practice, the successful extraction of DNA from clinical samples had to be demonstrated. Fetal DNA was therefore isolated from maternal plasma samples and tumor DNA was recovered after processing cancer patient samples. To be able to discriminate between male fetal or tumor and “normal” (maternal or healthy) DNA background, a gene localized on the Y-chromosome as well as specific DNA mutations were targeted. The final goal was not only to show the applicability for clinical samples, but also the compatibility with different analysis methods, so quantitative real-time PCR assays, BEAMing digital PCR technology, pyrosequencing, Qubit measurement, Agilent virtual gel electrophoresis and targeted sequencing were performed. Results The newly developed automated protocol and the QIAamp cNA Kit were comparable. Although DNA recovery using the reference method was higher for clinical samples the fraction of fetal or tumor DNA was very similar in most cases. So, if there was a DNA loss for the newly developed automated protocol, it should not only be specific for fetal or tumor DNA, but also be related to the “normal” DNA background. Looking at the results of Agilent virtual gel electrophoresis, DNA size distribution was almost the same between healthy individuals, maternal plasma samples and patients with cancer or other diseases. The main fraction mostly occurred in the length of mononucleosomes. Consequently, there was no obvious difference concerning DNA fragment length between plasma DNA from clinical samples and healthy individuals. Conclusion The newly developed automated protocol will help towards standardization and provides a good basis for the analysis of existing and the discovery of new biomarkers to push progress in the field of ccfNA as a non-invasive to minimally invasive diagnostic or prognostic tool.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.01.2019
Dateien geändert am:	18.01.2019
Promotionsantrag am:	13.03.2017
Datum der Promotion:	17.07.2017