Dokument: Die Rolle des Lektins LecB in der Physiologie und Pathogenität von Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Die Rolle des Lektins LecB in der Physiologie und Pathogenität von Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	The role of the lectin LecB in the physiology and pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43973
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171024-084546-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schwabroch, Tobias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.10.2017 / geändert 20.10.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Gram negative Bakterium P. aeruginosa ist opportunistisch humanpathogen und ist an einer Vielzahl von krankenhausassoziierten Infektionen und Infektionen von immunsupprimierten Patienten beteiligt. Der entscheidende Schritt für die erfolgreiche bakterielle Infektion ist die initiale Adhäsion des Bakteriums an die Wirtszelle und die Biofilmbildung. Sowohl die Adhäsion als auch die Biofilmbildung von P. aeruginosa wird unter anderem durch das Kohlenhydrat-bindenden Lektin LecB vermittelt, weshalb dieses als potentielles Ziel für die Entwicklung von Pharmazeutika gilt. Daneben ist LecB an der Mobilität des Bakteriums beteiligt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass LecB pleiotrope Einflüsse auf verschiedene Prozesse der Zelle, welche mit der Virulenz-assoziiert sind, aufweist. So konnte gezeigt werden, dass die Deletion von lecB in einem bestehenden P. aeruginosa lecB defizienten PATI4 Stamm einen Einfluss auf das Sekretom und die Menge an Biofilmen hat, sowie dass die intra wie extrazelluläre Esterase Aktivität beeinflusst wird. Natürlicherweise leben Bakterien zum Großteil eingebettet in Biofilmen und teilen sich ihre Umwelt mit anderen Organismen. Die Analyse der Biofilmbildung von co kultivierten P. aeruginosa und C. albicans Stämmen zeigte, dass die Deletion von lecB, nicht aber die Gegenwart von gereinigtem LecB, einen Einfluss auf die Menge des Biofilms in Co Kultivierung aufweist. Darüber hinaus konnten dieser Arbeit Hinweise auf einen regulatorischen Einfluss von OprF, welcher ein Interaktionspartner von LecB darstellt, auf lecB beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass ein P. aeruginosa oprF defizienter Stamm eine etwa 8 fach erhöhte Transkription von lecB aufweist und LecB früher (nach 7 h) als der Referenzstamm (nach 48 h) sekretiert. Die extrazelluläre LecB Menge ist in einem P. aeruginosa oprF defizienten Stamm nach 24 h 32 fach erhöht gegenüber dem Referenzstamm. Für die Aufklärung der Sekretion von LecB wurde ein P. aeruginosa PATS1 (ΔlecBΔoprF) Stamm konstruiert und mit dem plecB Expressionsvektor transformiert. Es konnte gezeigt werden, dass der plecB Expressionsvektor eine moderate konstitutive lecB Expression aufweist, welche der lecB Expression des Referenzstammes ähnelt. Dieser P. aeruginosa PATS1 Stamm mit plecB Expressionsvektor weist eine vom QS System entkoppelte konstitutive Expression von lecB auf und lokalisiert das LecB durch die fehlende Interaktion mit OprF im extrazellulären Medium. Die extrazelluläre Lokalisierung von LecB in einem P. aeruginosa oprF defizienten Stamm zeigte, dass OprF kein Sekretionspartner von LecB ist. Die extrazelluläre LecB Menge konnte mit dem in dieser Arbeit entwickelten und etablierten modified Enzyme-Linked Lectin Assay (mELLA ) Hochdurchsatzverfahren, welches eine Quantifizierung von LecB im linearen Bereich zwischen 0,25 62,5 ng/mL ermöglicht, quantifiziert werden. Die Kombination dieses Verfahrens mit dem ebenfalls hier erzeugten P. aeruginosa PATS1 Stamm mit plecB Expressionsvektor, der nach mELLA Quantifizierung je nach Kultivierungsbedingung, zwischen 26 bis 200 fach mehr LecB im extrazellulären Medium aufweist als der P. aeruginosa PA01 Referenzstamm, erwies sich als geeignetes System zur nachfolgenden Analyse der Sekretion von LecB mittels Transposon Bibliothek. Es wurde eine Tn5 Transposon Bibliothek im P. aeruginosa PATS1 Stamm mit plecB Expressionsvektor erzeugt, welche 6,5 x 104 Transposonmutanten umfasst. Diese Bibliothek wurde verwendet, um mithilfe des mELLA nach Stämmen zu suchen, welche eine reduzierte LecB Sekretion aufweisen, wobei 1,7 % von über 2.800 der untersuchten Transposonmutanten weniger als 15 % extrazelluläre LecB Menge im Vergleich zum Referenzstamm zeigen. Durch die Identifizierung des Transposonintegrationsortes wurden 15 Gene identifiziert, welche einen Einfluss auf LecB aufweisen könnten. Drei dieser Gene (fgtA, pilY1 und rocR) sind direkt oder indirekt an der Adhäsionsfähigkeit von P. aeruginosa beteiligt und geben Hinweise auf die Sekretion von LecB. Die zelluläre Funktion des FgtA ist die Glykosylierung des bakteriellen Flagellins FliC. In dieser Arbeit konnte ein negativer Einfluss auf die extrazelluläre Menge an LecB in weiteren P. aeruginosa fgtA und fliC defizienten Stämmen beobachtet und ein hypothetisches Modell zum Kohlenhydrat vermittelten Transport von LecB mit FliC abgeleitet werden. Dieses stützt die Hypothese früherer Studien, dass die Zuckerbindung für die Lokalisierung von LecB entscheidend ist und das LecB möglicherweise mit einem kohlenhydrathaltigen Liganden, zum Beispiel einem Glykoprotein wie FliC, co transportiert wird. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass LecB pleiotrope Einflüsse aufweist und tragen dazu bei (I) den Sekretionsmechanismus von LecB aufzuklären und (II) erlauben einen tieferen Einblick in die Regulation und Funktion des kohlenhydratbindenden Proteins LecB aus dem humanpathogen P. aeruginosa. The Gram negative bacterium P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen involved in a variety of hospital-acquired infections and infections of immunocompromised patients. The essential step for the successful bacterial infection is the initial adhesion of the bacteria to the host cell and the biofilm formation. Both the adhesion and the biofilm formation of P. aeruginosa are, beside other effectors, mediated by the carbohydrate binding lectin LecB. In addition to the adhesion and biofilm formation the lectin is involved in the mobility of the bacteria. Consequently, the LecB is regarded as a potential target for the development of pharmaceuticals. In this thesis, it was shown that LecB exhibits pleiotropic effects on different processes of the cell, which are associated with the bacterial virulence. Thus, the deletion of lecB in an existing P. aeruginosa lecB deficient strain has been shown to have an effect on the secretion, the biofilm amount as well as on the intra and extracellular esterase activity. Since bacteria mostly live in biofilms and share their environment with other organisms, the biofilm formation of co-cultured P. aeruginosa and C. albicans strains was analysed. The results showed that the deletion of lecB, but not exogenously purified LecB, has an influence on the amount of biofilm in co cultivation. In addition, the occurrence of a regulatory influence of OprF which is an interaction partner of LecB to lecB expression was observed. Accordingly, a P. aeruginosa oprF deficient strain has approximately 8-fold increased lecB transcription level and it secrets LecB earlier (after 7 h) than the reference strain (after 48 h). The extracellular LecB quantity is 32-fold increased in a P. aeruginosa oprF deficient strain after 24 h in contrast to the reference strain. The extracellular localization of LecB in a P. aeruginosa oprF deficient strain indicates that OprF is not a secretion partner of LecB. To elucidate the secretion of LecB, a P. aeruginosa lecB and oprF-deficient PATS1 (ΔlecBΔoprF) strain was constructed and transformed with the plecB expression vector. It was shown that the plecB expression vector exhibits moderate constitutive lecB expression, which is similar to the lecB expression of the reference strain. This P. aeruginosa PATS1 strain with plecB expression vector has a constitutive expression of lecB decoupled from the QS-system and localizes the LecB by the lack of interaction with OprF in the extracellular medium. The extracellular LecB quantity was quantified with the modified enzyme-linked lectin assay (mELLA) high-throughput method, which is developed and established in this work and allows the quantification of LecB in the linear range between 0.25-62.5 ng/ml. Using this method, it was shown that the P. aeruginosa PATS1 strain with a plecB expression vector, depending on the cultivation condition, had between 26 and 200 fold more LecB in the extracellular medium than the comparable P. aeruginosa PA01 reference strain. This method is suitable for the analysis of the LecB secretion. A Tn5 transposon mutant library of 6.5 x 104 clones was generated in the P. aeruginosa PATS1 strain with plecB expression vector. This library was used to identify strains with reduced LecB in the supernatant. The mELLA bases screening revealed that 1.7% out of the 2,800 investigated transposon mutants with less than 15% extracellular LecB amount compared to the reference strain. By identifying the transposon integration sites 15 genes potentially involved in LecB secretion were identified. Three of these genes (fgtA, pilY1 and rocR) involved in the adhesion of P. aeruginosa can likely be functionally linked to LecB. The cellular function of FgtA is the glycosylation of the bacterial flagellin FliC. In this thesis, a decreased extracellular amount of LecB was observed in additionally tested mutant strains of P. aeruginosa being deficient for fgtA and fliC. Based on our data and previous findings that the sugar binding is critical for the cell localization of LecB we suggest a model of carbohydrate-mediated co-transport of LecB with a glycoprotein, like FliC. The results of the present study show that LecB has pleiotropic influences and they contribute to (I) elucidating the secretory mechanism of LecB and (II) allow a deeper insight into the regulation and function of the carbohydrate-binding protein LecB of the human pathogen P. aeruginosa.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	24.10.2017
Dateien geändert am:	24.10.2017
Promotionsantrag am:	21.06.2017
Datum der Promotion:	11.10.2017