Dokument: Identifizierung und biotechnologische Anwendungen Polymer-bindender Peptide

Titel:	Identifizierung und biotechnologische Anwendungen Polymer-bindender Peptide
Weiterer Titel:	Identification and biotechnological applications of polymer-binding peptides
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43765
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171009-101544-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	MSc Weber, Joanna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.10.2017 / geändert 08.10.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In den letzten Jahrzehnten hat die kommerzielle Nutzung synthetischer Polymere kontinuierlich zugenommen. Polyethylenterephthalat (PET) und Polypropylen (PP) gehören zu den meist produzierten Kunststoffen und werden vorrangig in der Textil- und Verpackungsindustrie verwendet. Aufgrund des hydrophoben Charakters der Materialien sind häufig Oberflächenmodifizierungen für industrielle Anwendungen erforderlich, welche konventionell durch chemische oder physikalische Verfahren realisiert werden. Peptide mit Affinität gegenüber synthetischen Polymeren können hingegen umweltschonende Prozesse sowie vielseitige Funktionalisierungen ermöglichen und waren Untersuchungsobjekte dieser Arbeit. Der Fokus lag hier auf Kunststoff-affinen Peptiden, die mit funktionalen Bausteinen wie Pigmenten zur Färbung von Textilien oder thermoexpandierenden Mikrosphären (TEMs) zur Abdichtung von Nähten auf synthetischen Polymeren verankert werden. Interessante Peptid-Kandidaten sind Kohlenhydrat-bindende Module (CBMs) und antimikrobielle Peptide (AMPs), da sie an natürliche Polymere wie Polysaccharide bzw. Zellmembranen binden. CBMs wurden bereits erfolgreich als PET-bindende Peptide genutzt und an PET-hydrolysierende Enzyme fusioniert, um deren Substrataffinität zu steigern. In dieser Arbeit wurden zur Identifizierung weiterer PET-Bindepeptide acht CBMs auf der Basis von Struktur- und Sequenzdaten rational ausgewählt, heterolog exprimiert und die PET-Affinität in vitro überprüft. Hierzu wurde ein „PET Surface Affinity Assay“ entwickelt, der es ermöglicht die PET-Affinität von Proteinen semi-quantitativ zu evaluieren. In diesem Testverfahren zeigten die fünf CBMs PpCBM1, BaCBM2, BsCBM2, BlCBM5 und ucCBM10 eine Affinität zu PET. Insbesondere BaCBM2 stellte sich als vielversprechender Kandidat für industrielle Anwendungen heraus und fungierte als Modell-Bindepeptid, um die Wechselwirkung zwischen CBMs und PET zu studieren. Die Kombination aus in silico und in vitro Methoden zeigte, dass exponierte Aromaten des Peptids über π-stacking Interaktionen sowie polare Reste über Wasserstoffbrückenbindungen mit PET interagieren. In einer ersten Machbarkeitsstudie konnte BaCBM2 erfolgreich zur Funktionalisierung von PET mit TEMs eingesetzt werden. Zudem konnte das Anwendungspotential von BaCBM2 durch den Einsatz in der Methodenentwicklung zur Detektion von PET-Nanoplastik demonstriert werden. Durch Projektpartner wurden strukturell unterschiedliche AMPs als PP-Bindepeptide identifiziert und das Funktionalisierungspotential von PP mit einem der Peptide (LCI) gezeigt. Die rekombinante Produktion von LCI im großen Maßstab stellt jedoch durch die antimikrobiellen Eigenschaften eine Herausforderung dar. Um das LCI zur Funktionalisierung von PP in großtechnischen Verfahren anwenden zu können, wurde daher in dieser Arbeit ein passendes, mikrobielles Produktionssystem identifiziert und etabliert. Mit Pichia pastoris als Expressionswirt konnten 0,69 g/L LCI erreicht werden. Das rekombinante LCI zeigte weiterhin eine Bindung an PP und konnte beispielhaft zur homogenen Beschichtung von hydrophoben Oberflächen verwendet werden. Zusammenfassend konnten neue Bindepeptide für vielfältige Anwendungsfelder identifiziert, produziert und charakterisiert werden. Die Identifizierung eines geeigneten Expressionssystems für das PP-Bindepeptid LCI ermöglicht erstmals die Entwicklung eines großtechnischen, Peptid-basierten Verfahrens zur PP-Funktionalisierung. Die Ergebnisse dieser Studie tragen daher zum Fortschritt in der biotechnologischen Anwendung Polymer-bindender Peptide bei. The commercial use of synthetic polymers has steadily increased over the past decades. Poly(ethylene terephthalate) (PET) and polypropylene (PP) are amongst the most produced polymers, finding application mainly in textile and packaging industry. Due to their highly hydrophobic properties, surface modifications of the materials are often crucial for industrial applications. Such modifications are conventionally realized by physical or chemical processes. In contrast, peptides with an affinity for synthetic polymers could enable eco-friendly processes as well as versatile functionalizations and were subject of this thesis. Main focus was on plastic-affine peptides that can be anchored on synthetic polymers, together with functional building blocks like pigments for dyeing of textiles or thermo-expansive microspheres (TEMs) for waterproof sealing of seams. Interesting peptide-candidates are carbohydrate-binding modules (CBMs) and antimicrobial peptides (AMPs) as they can bind natural polymers like polysaccharides and cell membranes, respectively. CBMs have already been successfully applied as PET-binding peptides and fused to PET-hydrolyzing enzymes in order to increase substrate affinity. In this study, additional PET-binding peptides were identified by rationally selecting eight CBMs based on structure- and sequence data. The selected peptides were heterologously expressed and their affinity assessed in vitro. To this end, a “PET Surface Affinity Assay” was developed that enables semi-quantitative evaluation of the PET-affinity of proteins. PET-affinity could be shown for CBMs PpCBM1, BaCBM2, BsCBM2, BlCBM5 and ucCBM10 using this technique. Notably BaCBM2 turned out to be a promising candidate for industrial applications and was used as a model binding-peptide to investigate CBM-PET interplay. The combined in silico and in vitro analyses revealed PET interaction of exposed aromatic residues of the peptide via π-stacking interactions and of polar residues via hydrogen bonding. Furthermore, BaCBM2 could successfully be applied to functionalize PET with TEMs in a first feasibility study and its application potential could be demonstrated during development of a PET-nanoplastic detection method. Project partners identified structurally diverse AMPs as PP-binding peptides and could show the functionalization potential of PP with one of the peptides (LCI). However, large scale production of recombinant LCI is challenging due to its antimicrobial properties. In order to apply the LCI for functionalization of PP in large scale processes, a suitable microbial expression system was identified and established in this work. Using Pichia pastoris as an expression host a yield of 0.69 g/L LCI was obtained. The recombinant LCI still showed PP binding and could be used to homogenously coat hydrophobic surfaces. Overall, new binding peptides for versatile areas of application could be identified, produced and functionally characterized. The identification of a suitable expression system for the PP-binding peptide LCI furthermore enables the development of a peptide-based PP-functionalization process for industrial purposes for the first time. Thus, the results of this study contribute to the progress in biotechnological applications of polymer-binding peptides.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.10.2017
Dateien geändert am:	09.10.2017
Promotionsantrag am:	29.05.2017
Datum der Promotion:	30.08.2017