Dokument: Muscle Lim Protein in naïve and injured neurons

Titel:	Muscle Lim Protein in naïve and injured neurons
Weiterer Titel:	Muscle Lim Protein in intakten und verletzten Neuronen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43682
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171010-112851-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Levin, Evgeny [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,40 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.10.2017 / geändert 02.10.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Fischer, Dietmar [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Neurone des adulten zentralen Nervensystems (ZNS) sind auf dem natürlichen Weg nicht in der Lage ihre durchtrennten Axone zu regenerieren. Obwohl die Neurone des peripheren Nervensystems (PNS) hingegen relativ effizient neue Axone bilden können, führt diese Regeneration jedoch oft nicht zu einer vollständigen Wiederherstellung der Funktion im betroffenem Gewebe. Die Entwicklung neuer Therapieoptionen, um die axonale Regeneration zu fördern, setzt ein detailliertes Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen voraus. Muscle Lim Protein (MLP) gilt bislang als ein muskelspezifisches Protein. Es ist besonders stark im Herzgewebe exprimiert. Dort übernimmt MLP viele wichtige Funktionen. Zwei Studien haben bereits festgestellt, dass die mRNA von MLP auch in axotomierten Neuronen des PNS hochreguliert wird (Newton et al., 2000; Stam et al., 2007). Dennoch wurde noch nie untersucht, ob MLP dort tatsächlich als Protein vorliegt bzw. wie schnell, wie lange und in welchen Zellen genau es exprimiert wird. Auch über die Funktion von MLP in Neuronen ist nichts bekannt. Darüber hinaus wurde seine Expression im intakten Nervengewebe noch nie untersucht. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Expression von MLP in Spinalganglien der Ratten nach einer Verletzung des Ischiasnervs untersucht. Dabei konnte die bereits zuvor beschriebene Induktion der Mlp-mRNA bestätigt werden und darüber hinaus wurde in ca. 10% der axotomierten Neuronen zum ersten Mal auch MLP als Protein nachgewiesen. Die meisten von ihnen konnten sieben Tage nach einer Ischiasnervverletzung nicht einer der typischen Subpopulationen der Spinalganglienneurone zugeordnet werden. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, dass der Großteil der MLP-produzierenden Zellen aus der Subpopulation der Isolektin B4-positiven Nozizeptoren hervorgingen, welche in Folge der Axotomie ihre Fähigkeit das Lektin zu binden verloren haben. In dem zweiten Teil dieser Doktorarbeit sollte überprüft werden, ob MLP auch während der embryonalen oder der postnatalen Entwicklung der Neurone exprimiert wird. Hierfür wurden embryonalen und postnatalen Retinae von Ratten mittels quantitativer PCR, Western Blot-Analyse und Immunhistochemie untersucht. Tatsächlich wurde eine Hochregulation von MLP in den Retinae zwischen dem embryonalen Tag 20 (E20) und dem postnatalen Tag 14 (P14) festgestellt. Das Protein wurde ausschließlich in cholinergen amakrinen Zellen gebildet. Dabei waren alle diese Zellen positiv für MLP zwischen P7 und P14, regulierten die Expression des Proteins jedoch daraufhin komplett wieder herunter. Für die zukünftige Aufklärung der Rolle und des Wirkmechanismus von MLP in der axonalen Regeneration wird unter anderem die Durchführung von Zellkultur-Assays mit genetisch veränderten Neuronen notwendig sein. Bekanntermaßen existiert bislang jedoch keine Methode, die ein effizientes Einschleusen vom genetischen Material in primäre adulte Neurone in vitro ermöglicht. Aus diesem Grund wurde dafür im Rahmen dieser Doktorarbeit ein neuer Ansatz basierend auf der Verwendung von Baculoviren etabliert. Die eingesetzten Viren (BacMam) waren mit dem Glykoprotein VSV-G pseudotypisiert und ermöglichten die Expression von Transgenen gesteuert durch CMV-Promotoren. BacMam-Vektoren erreichten reproduzierbare Trasduktionsraten von bis zu 80% in Zellkulturen der RGZ und der Spinalganglienneuronen. Dabei wurden die eingeschleusten Gene bereits innerhalb von 24 Stunden nach der Zugabe von Viren exprimiert. Darüber hinaus haben in Fällen, in denen Zellen mit zwei verschiedenen Viren gleichzeitig behandelt wurden, alle transduzierten Neurone beide Reportergene exprimiert, was die Verwendbarkeit des BacMam-Systems für Co-Transduktionsexperimente ermöglicht. Mit Cre- und hIL6-Bakuloviren haben wir zudem die Funktionalität der baculoviral exprimierten Proteine bestätigen können, was die Einsetzbarkeit der Methode für neuronale Assays untermauert. Mature neurons of the central nervous tissue (CNS) do not normally regenerate their lesioned axons. Although neurons of the peripheral nervous system (PNS) are on the contrary able to regrow axons in the injured nerves, this regeneration often does not result in a complete functional restoration. The development of effective therapeutic strategies for the improvement of axonal regeneration requires the exploration of corresponding molecular mechanisms. Muscle Lim Protein (MLP) has so far been mainly regarded as a muscle-specific protein with a particularly high abundance in heart myocytes and diverse cellular functions. Two studies also reported upregulation of Mlp-mRNA in axonally injured PNS neurons (Newton et al., 2000; Stam et al., 2007). However, neither the levels of MLP-protein, nor its spatiotemporal expression pattern or function in the intact or lesioned nervous tissue have been investigated until now. Within the scope of this thesis, MLP expression was investigated in the dorsal root ganglia (DRG) of rats upon sciatic nerve crush (SNC). Thereby, we were able to confirm previous reports on upregulated Mlp-mRNA levels in this nerve injury model and also detected for the first time the presence of translated protein in about 10% of DRG neurons. This distinct subset of cells could not be assigned to any of the canonical neuronal subpopulations of DRG seven days after SNC. Nevertheless, further detailed investigations revealed that the majority of MLP expressing cells arose from the well-characterized subpopulation of Isolectin B4-positive nociceptors, which gradually downregulated their ability to bind the lectin upon axotomy. Another objective of this thesis was to explore whether MLP is also induced during the embryonic and postnatal development of nervous tissue. To this end, embryonic and postnatal retinae of rats were analyzed using quantitative PCR, Western blot and immunohistochemical methods. We found upregulation of MLP in cholinergic amacrine cells between embryonic day 20 (E20) and postnatal day 14 (P14). Strikingly, all cholinergic amacrine interneurons were MLP-positive between P7 and P14. Thereafter, the expression of the protein decreased and was no longer detectable in the adult retinae. Precise investigations on the possible role and the molecular mechanism of MLP in axonal regeneration would most likely involve extensive in vitro experiments with genetically modified adult neurons. However, mature neurons are notoriously insusceptible to genetic manipulations by the common in vitro gene delivery techniques. Therefore, the last part of this thesis focused on the establishment of an efficient baculovirus-based in vitro transduction method for primary postnatal and adult CNS and PNS neuron. VSV-G pseudotyped baculoviruses (BacMam) were used to deliver reporter genes, expressed under the regulation of CMV-promoter, to cultures of RGC and DRG neurons. Transduction rates of up to 80% were reproducibly achieved by this approach. Moreover, the induction of transgene expression was detected within only 24 hours following the application of viruses. If two different viruses were added simultaneously, almost all transduced cells co-expressed both reporter proteins, making the BacMam-system suitable for co-transduction experiments. Finally, using Cre- and hIL6-baculoviruses we confirmed fully functional transgene expression, enabling execution of neuronal assays in vitro.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	10.10.2017
Dateien geändert am:	10.10.2017
Promotionsantrag am:	23.06.2017
Datum der Promotion:	12.09.2017