Dokument: Establishment of Bacterial Microcompartments in the Industrial Production Strain Corynebacterium glutamicum

Titel:	Establishment of Bacterial Microcompartments in the Industrial Production Strain Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Etablierung bakterieller Mikrokompartimente im industriellen Plattformorganismus Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43480
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171006-111457-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Huber, Isabel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,09 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.09.2017 / geändert 28.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	Bacterial microcompartments, propanediol utilization, metabolic engineering, protein encapsulation, C. glutamicum
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Bakterielle Mikrokompartimente besitzen ein großes Potential im Bereich der industriellen Biotechnologie zur Produktion von niedermolekularen Verbindungen mit giftigen oder flüchtigen Zwischenprodukten. Corynebacterium glutamicum ist ein industriell etablierter Plattformorganismus zur Produktion von Aminosäuren und wurde außerdem für die Produktion von Diaminen, Dicarbonsäuren, Polymeren und bio-basierten Kraftstoffen erschlossen. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung der Kompartiment-Produktion in C. glutamicum und die Bereitstellung nützlicher Werkzeuge im Hinblick auf deren biotechnologische Anwendung als Nano-Bioreaktoren. Während dieser Arbeit wurden optimierte Varianten eines Operons zur Expression der Hüllgene des 1,2-Propandiol nutzenden Pdu-Kompartimentes aus Citrobacter freundii konstruiert. Nach Induktion der Hüllgenexpression konnten Elektronenmikroskopie-Aufnahmen die heterologe Kompartiment-Assemblierung belegen. Wachstumsstudien zeigten einen drastischen Effekt der Kompartiment-Produktion in C. glutamicum, jedoch konnte das Wachstum durch die genomische Integration des Hüllgen-Clusters verbessert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das Hüllprotein PduA tubuläre Strukturen in C. glutamicum formt und spezifische Peptidsequenzen Fluoreszenzproteine zu den Strukturen lokalisieren können. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Möglichkeit solche Filament-Strukturen als Gerüste für eine gerichtete zelluläre Organisation von Enzymen zu nutzen und damit zur Produktivitätssteigerung von Stoffwechselwegen beizutragen. Um das Potential der Mikrokompartimente zu beurteilen, wurden ein Methanol-Abbauweg und ein Ethanol-Produktionsweg ausgewählt, welche beide ein giftiges Aldehyd-Zwischenprodukt besitzen. Der außerdem untersuchte Itaconsäure-Produktionsweg besitzt das kurzlebige Intermediat Cis-Aconitat. Als gemeinsame Schwierigkeit stellte sich jedoch heraus, dass einige der Enzyme mit N-terminalen Lokalisations-Peptiden in ihrer Funktion eingeschränkt waren, wie etwa AdhB, ein Enzym innerhalb des Ethanol-Abbauweges und MalECad, welches für die Itaconsäure-Produktion benötigt wird. Die beiden Enzyme zeigten eine auf 17% bzw. 35% reduzierte Aktivität. Das Enzym Hps, beteiligt an der Methanol-Verwertung, war mit dem Lokalisations-Peptid inaktiv. Um das Repertoire an synthetischen Lokalisations-Peptiden zu erweitern wurden zwei alternativen Strategien zur Lokalisierung von Enzymen mittels C-terminalen Peptiden entwickelt. Dies bietet die Möglichkeit den optimalen Fusionspartner spezifisch für jedes Enzym wählen zu können. Durch die Nutzung eines C-terminalen Lokalisations-Peptids an AdhB konnte eine 18% höhere Enzymaktivität im Vergleich zur Nutzung eines N-terminalen Lokalisations-Peptids erreicht werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die heterologe Kompartiment-Produktion in C. glutamicum möglich ist und bietet außerdem wichtige Grundlagen für weitere Studien zur biotechnologischen Nutzung der Mikrokompartimente. Bacterial microcompartments (BMCs) have significant potential in the area of industrial biotechnology for the production of small molecules with toxic or volatile intermediates. Corynebacterium glutamicum is an established industrial platform organism for the production of amino acids and was made accessible for the production of diamines, dicarboxylic acids, polymers and bio-based fuels. The aim of this study was to establish BMC production in C. glutamicum and to provide useful tools towards a biotechnological application of BMCs as nano-bioreactors. Within this study, optimized gene clusters for the expression of the Citrobacter freundii propanediol utilization compartment shell genes were constructed. Upon induction in C. glutamicum, transmission electron microscopy images revealed heterologous compartment production and assembly in the mid cell. Growth studies demonstrated a drastic negative impact of BMC production in C. glutamicum but reasonable results were obtained with the chromosomal integration of the gene cluster. To evaluate the potential of BMCs in C. glutamicum, the methanol consumption and the ethanol production pathway, which both include a toxic aldehyde intermediate, and the itaconate production pathway including a transient intermediate, were used. One issue, however, was to produce the enzymes tagged with N-terminal encapsulation peptides in an active form. For the methanol consumption pathway, the enzyme Hps was inactive and also AdhB for ethanol production and MalECad for itaconate production showed reduced activities of 17% and 35% respectively. To expand the synthetic repertoire of encapsulation peptides, new strategies to target proteins of interest into the compartment lumen were investigated. Using fluorescence microscopy, it was proven that a none-native C-terminal targeting peptide from Klebsiella pneumonia and three synthetic scaffolding peptides are able to localize a fluorescence reporter into the compartment lumen. The establishment of the alternative the C-terminal targeting strategy now offers the opportunity to choose the optimal fusion for the particular protein of interest. This was, for example demonstrated with C-terminally targeted AdhB versions, restoring an 18% higher enzymatic activity than the N-terminally targeted AdhB version. PduA formed bundles of filaments in C. glutamicum and encapsulation peptide tagged fluorescence reporters localized to those structures. This demonstrates that there is the opportunity to use the nanotube-like structures as scaffolds for directed cellular organization and pathway enhancement. Altogether, this work provides essential fundamental groundwork on heterologous BMC or scaffold formation in C. glutamicum and paves the way for metabolic engineering of pathways with toxic or volatile intermediates or pathways with competing reactions.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	06.10.2017
Dateien geändert am:	06.10.2017
Promotionsantrag am:	09.06.2017
Datum der Promotion:	27.07.2017