Dokument: In-vitro Regeneration von sekretorisch aktivem, porcinem Tränendrüsengewebe

Titel:	In-vitro Regeneration von sekretorisch aktivem, porcinem Tränendrüsengewebe
Weiterer Titel:	Bio-engineering of porcine lacrimal gland tissue with secretory capacity
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43466
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170915-080814-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. med. Spaniol, Kristina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.09.2017 / geändert 14.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. med. Geerling, Gerd [Gutachter] Prof. Dr. Rüther, Ulrich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das trockene Auge ist eine weltweit verbreitete Erkrankung und stellt eine persönliche sowie volkswirtschaftliche Belastung dar. Die Tränendrüseninsuffizienz, die nach Traumata, Bestrahlung im Kopf-Hals-Bereich, bei Autoimmunerkrankungen und kongenitaler Alacrimie auftreten kann, ist eine Hauptursache für ein schweres trockenes Auge und führt zu schmerzhaften Augenoberflächenstörungen bis hin zum Verlust der Sehkraft. Heutzutage gibt es keine kurative Therapie für diese Erkrankung. In-vitro und in-vivo Studien zur Tränendrüsenregeneration wurden hauptsächlich an Nagern durchgeführt, deren Tränendrüsen sich in Bezug auf Anatomie, Physiologie und Histologie zum Teil deutlich vom Menschen unterscheiden. Einige Autoren haben Ergebnisse aus Arbeiten an Primaten publiziert. Diese Spezies wird aber aus ethischen Gründen in Europa selten für Tierversuche eingesetzt. Das Hausschwein (Sus Scrofa) ähnelt dem Menschen in Bezug auf Größe, Anatomie und Genetik. Arbeiten zur Kultur von sekretorisch aktiven azinären Tränendrüsenepithelzellen des Schweines liegen aber bisher nicht vor. Bis heute wurden azinäre Tränendrüsenepithelzellen mit Hilfe einer sogenannten Suspensionskultur isoliert, welche mehrere enzymatische Verdau- und Filtrationsschritte beinhaltet. Diese Methode ist zeitaufwendig, kostspielig und benötigt große Gewebemengen, was ihre klinische Anwendbarkeit deutlich einschränkt. Der einzige bisher erfolgreiche Versuch dreidimensionales Tränendrüsengewebe in-vitro zu rekonstruieren ist an embryonalem Gewebe von Mäusen erfolgt und daher aus ethischer Sicht in dieser Form nicht auf die Klinik übertragbar. Das Ziel dieser Arbeit war zunächst die Kultur und Charakterisierung sekretorisch aktiver Schweinetränendrüsenepithelzellen um das Hausschwein als mögliches neues Tiermodel für Tränendrüsenstudien zu etablieren. Weiterhin wurde eine technisch einfache Explantkultur mit der etablierten Suspensionskultur verglichen um ein klinisch anwendbares Kultursystem für Tränendrüsenepithelzellen verfügbar zu machen. Schließlich wurde die dezellularisierte Schweinetränendrüse als Matrix für die Kultur von Tränendrüsenepithelzellen untersucht, um ein dreidimensionales, sekretorisch aktives Tränendrüsengewebe in-vitro zu rekonstruieren. Primäre, azinäre Tränendrüsenepithelzellen konnten mittels der Suspensions- und Explantkultur erfolgreich aus Tränendrüsen des Schweines isoliert werden, wobei mit Hilfe der Explantkultur aus einer 3,4 mm3 Biopsie ebenso viele Zellen gewonnen wurden wie aus einer 100 mm3 Biopsie durch die Suspensionskultur. Zellen aus beiden Isolationsmethoden wurden bis zu 30 Tage in-vitro kultiviert und zeigten keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf epithelialen Phänotyp, proliferative Kapazität und sekretorische Kompetenz, was mit Hilfe von Immunfärbungen, Elektronenmikroskopie, Durchflusszytometrie und funktioneller Testung mittels ß-Hexosaminidase-Assay untersucht wurde. Schweinetränendrüsengewebe konnte dezellularisiert werden, während die histologische Struktur und wichtige Extrazellulärmatrixproteine erhalten blieben und sich in-vitro keine Zytotoxizität der dezellularisierten Gewebe zeigte. Tränendrüsenepithelzellen aus Suspensions- und Explantkultur wurden unter Erhalt ihres epithelialen Phänotyps in diese Matrix zurückbesiedelt. Sie bildeten Azinus-ähnliche Strukturen und behielten ihre sekretorische Fähigkeit für bis zu eine Woche. Eine Langzeitkultur über 28 Tage führte zu einer Re-Besiedlung und einem Umbau tiefer liegender Gewebestrukturen im Zentrum der Matrices. Ebenso war die allogene Kultur von Kaninchentränendrüsenzellen in der dezellularisierten Schweinetränendrüsenmatrix unter passagerem Erhalt der sekretorischen Kapazität möglich. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass das Hausschwein ein geeignetes Tiermodel für laborexperimentelle Tränendrüsenstudien ist. Die Explantkultur stellt eine Gewebe- und Zeit-sparende und somit möglicherweise klinisch anwendbare Methode zur Isolation von sekretorisch aktiven Tränendrüsenzellen dar. Die dezellularisierte Schweinetränendrüse ist eine supportive Matrix für die Re-Besiedlung mit adulten (allogenen) Tränendrüsenepithelzellen für die Rekonstruktion von dreidimensionalem, sekretorisch aktivem Tränendrüsengewebe in-vitro. In-vivo Studien und die Kultur von humanen Tränendrüsenepithelzellen sind erforderlich um die Anwendbarkeit der Explantkultur auf menschliches Tränendrüsengewebe und Eignung der dezellularisierten Schweinetränendrüse als mögliche Matrix für Transplantationsstudien weiter evaluieren zu können. Dry eye is a worldwide disease and a personal as well as economic burden. Lacrimal gland deficiency can occur after trauma, radiation therapy of head and neck, due to autoimmune diseases or congenital alacrimia and is a main cause for severe dry eye leading to painful ocular surface disease and potentially loss of vision. Today, no causative treatment is available. In-vitro and in-vivo studies on lacrimal gland regeneration mainly use rodent tissue, which differs from the human in terms of anatomy, physiology, and histological ultrastructure. Some authors worked with primate tissue but the availability of primates for animal testing in Europe is restricted due to ethic concerns. The domestic pig (Sus Scrofa) is similar to humans with regard to size, anatomy, and genetic background but studies on secretory porcine lacrimal gland epithelial cells have not been performed until today. So far, secretory competent lacrimal gland cells were cultured by a suspension culture method, which includes several enzymatic digestion and filtration steps. It is therefore time consuming, expensive, and requires large amounts of tissue, which impedes its clinical applicability. Until today, the only successful approach to engineer three-dimensional lacrimal gland matrix utilized embryonic mouse tissue and can therefore not be transferred into clinic in the current form. This work first aimed to culture and characterize secretory competent porcine lacrimal gland cells to establish the domestic pig as a potential new animal model for lacrimal gland studies. Second, a simple explant culture method was compared to the suspension culture to establish a clinically usable culture system for lacrimal gland cells. Third, decellularized lacrimal gland tissue was characterized and evaluated as a matrix for the culture of lacrimal gland epithelial cells to bioengineer three-dimensional, secretory competent lacrimal gland tissue. Primary porcine lacrimal gland acinar epithelial cells were successfully isolated from fresh porcine lacrimal glands by suspension and explant culture, while in terms of explant culture a 3.4 mm3 biopsy obtained as many cells as a 100 mm3 biopsy treated by suspension culture. Cells from both isolation methods were maintained in-vitro for about 30 days without significant differences regarding epithelial phenotype, proliferative capacity, and secretory competence as proofed by immunostaining, electron microscopy, flow cytometry, and functional testing by ß-hexosaminidase assay. Lacrimal gland tissue was decellularized under preservation of the histological structure and main extracellular matrix proteins and this tissue did not convey cytotoxicity in-vitro. Lacrimal gland epithelial cells from suspension and explant culture were successfully reseeded into this matrix. They maintained their epithelial phenotype, formed acinus-like structures, and were secretory competent for up to one week. Long-term culture for 28 days induced deeper cell growth into and remodeling of the matrix. Further, rabbit lacrimal gland epithelial cells were cultured in the decellularized porcine lacrimal gland matrix under temporary maintenance of their secretory capacity. In conclusion, this work introduces the domestic pig as an easily available animal model for lacrimal gland studies. Explant culture proofed to be a time saving method to isolate secretory competent lacrimal gland epithelial cells. It is tissue sparing and might therefore be a clinically applicable culture method for this vulnerable cell type. Decellularized porcine lacrimal gland proofed to be a supportive, three-dimensional matrix for the engineering of secretory competent, bioartificial lacrimal gland tissue in-vitro applying adult (allogeneic) lacrimal gland epithelial cells. In-vivo studies and work on human lacrimal gland cells are clearly needed to further validate the applicability of the explant culture method for human lacrimal gland cells and the decellularized porcine lacrimal gland as a potential matrix for transplantation studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	15.09.2017
Dateien geändert am:	15.09.2017
Promotionsantrag am:	21.04.2017
Datum der Promotion:	11.09.2017