Dokument: eNOS Signaling Pathway in Red Blood Cells Contributes to Deformability and ATP Release

Titel:	eNOS Signaling Pathway in Red Blood Cells Contributes to Deformability and ATP Release
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43453
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170914-101044-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ziegler, Maximilian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.09.2017 / geändert 13.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Dr. rer. nat. Cortese-Krott, Miriam [Gutachter] Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Hintergrund Die Entwicklung und das Voranschreiten kardiovaskulärer Erkrankungen stehen mit endothelialer Dysfunktion in Verbindung. Herabgesetzte Bioverfügbarkeit von Stickstoffmonoxid (NO) wird sowohl als Auslöser als auch Charakteristikum endothelialer Dysfunktion angesehen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass Erythrozyten eine aktive endotheliale NO-Synthase (eNOS) besitzen. Diese trägt zum vaskulären NO-Pool bei. Bei Patienten, die unter endothelialer Dysfunktion leiden, ist die Funktion der erythrozytären eNOS signifikant eingeschränkt. Die exakte Rolle der eNOS in Erythrozyten ist unklar. Ziel Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, soluble guanylate cyclase (sGC) und protein kinase G1 (PRKG1) in adulten, humanen Erythrozyten zu identifizieren. Beide Proteine sind Bestandteil der eNOS Signalkaskade, die aus dem Gefäßsystem bekannt ist. Zusätzlich untersucht die Arbeit die Funktion von sGC und PRKG1 im Hinblick auf Verformbarkeit und Einfluss auf Pannexin 1 Kanäle (Pnx1) in Erythrozyten, die Adenosintriphosphat (ATP)-Freisetzung erlauben. Methoden Die Identifizierung der Proteine erfolgt mittels Western Blot Analysen. Die Auswirkung kardiovaskulärer Erkrankung und Hypertonie auf den Proteingehalt von Erythrozyten wird ebenfalls mittels Western Blot untersucht. Die Messung der PRKG1 Aktivität wurde mittels enzyme-linked immunosorband assay (ELISA) durchgeführt. Bei verschiedenen Scherkräften wurde die Deformierbarkeit von Erythrozyten mit einem Ektazytometer gemessen. Der Einfluss von sGC und PRKG1 auf erythrozytäre Verformbarkeit wurde als Elongationsindex (EI) nach verschiedenen Behandlungen untersucht. Eine Kombination aus Durchfluss- und Ektazytometrie wurde etabliert, um den Einfluss erythrozytärer Verformung auf eNOS-Aktivierung zu untersuchen. Eine weitere durchflusszytometrische Methodik wurde etabliert, um die Rolle der eNOS-Signalkaskade mit Blick auf Pnx1 zu klären. Ergebnisse Die Western Blot Ergebnisse zeigen, dass adulte, humane Erythrozyten eine sGC und PRKG1 tragen. Die Analyse der Proteinmengen zwischen gesunden Testpersonen und Patienten, die unter koronarer Herzerkrankung (KHK) und Hypertonie leiden, weisen keine signifikanten Unterschiede auf. Die Ergebnisse der ELISA ergeben, dass die PRKG in Erythrozyten aktiv ist. Ektazytometrische Messungen zeigen, dass die Aktivierung der eNOS/ sGC/ PRKG1-Signalkaskade mittels SperNO und 8-bromo cGMP die Verformbarkeit signifikant verbessert. Im Gegensatz dazu verringern die Inhibitoren DT2 und ODQ die Verformbarkeit signifikant. Durchflusszytometrische Messungen deuten darauf hin, dass eNOS, sGC und PRKG1 an der Regulation von Pnx1 beteiligt sind. Der Pnx1-Inhibitor Carbenoxolone verringert signifikant das Fluoreszenzsignal innerhalb von Erythrozyten. Inhibierung von NOS und PRKG1 führen ebenfalls zu signifikant erhöhter intrazellulärer Fluoreszenz. Die Behandlung von Erythrozyten mit 8-bromo-cGMP verringert dosisabhängig signifikant das Fluoreszenzsignal. Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit zeigt, dass reife, humane Erythrozyten eine sGC und eine PRKG1 tragen. Beide Proteine sind fester Bestandteil der eNOS-Signalkaskade innerhalb von Erythrozyten. Sie führen zu einer signifikanten Steigerung der Verformbarkeit bei niedrigem Scherstress. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit erstmals, dass die eNOS-Signalkaskade an der Regulation von Pnx1 beteiligt ist. Background The development and progression of cardiovascular diseases is correlated to endothelial dysfunction. Decreased nitric oxide (NO) bioavailability is considered to be both a characteristic and a cause of endothelial dysfunction. NO is produced by a group of NO synthases (NOS). Recently it was shown that red blood cells (RBCs) carry an active endothelial NOS (eNOS), which contributes to the vasculature´s NO pool. In patients who suffer from endothelial dysfunction the activity of RBC-eNOS is significantly impaired compared to healthy controls. The exact role of RBC-eNOS remains uncertain. Aims The aim of this work is to identify soluble guanylate cyclase (sGC) and protein kinase G1 (PRKG1) in mature human RBCs. Both proteins are part of the eNOS signaling pathway, which is known from the vasculature. Additionally the work investigates the function of sGC and PRKG1 with regard to RBC deformability and influence on pannexin 1 (pnx1), which is an adenosine triphosphate (ATP) gating channel in RBCs. Methods The detection of sGC and PRKG1 in RBCs was performed using western blot analyses. Western blot analyses were also used to investigate the influence of coronary artery disease (CAD) and hypertension on protein quantities in RBCs. Measurement of PRKG1 activity in RBCs was assessed by an enzyme-linked immunosorband assay (ELISA). Deformability was analyzed by Laser assisted optical rotational red cell analyzer (LORRCA) at different levels of shear stress. The influence of eNOS, sGC and PRKG1 on deformability was assessed as elongation index (EI) after different treatments. A combination of flowcytometric and ectacytometric analyses has been established to investigate the influence of deformation on RBC-eNOS activity. Flowcytometric measurements were established to elucidate the role of eNOS signaling with regard to pnx1. Results Western blot results show that mature human RBCs carry a sGC and PRKG1. The analysis of protein quantities does not reveal significant differences between healthy test persons and patients who suffer from CAD and hypertension. ELISA reveals that an active PRKG can be found in RBCs. The results of ectacytometric measurements show that activation of the eNOS/ sGC/ PRKG1-signaling cascade in RBCs with SperNO and 8-bromo-cGMP significantly contributes to improved deformability. In contrast inhibition with DT2 and ODQ significantly decreases the ability of RBCs to deform. Flowcytometric measurements adduce evidence that eNOS/ sGC/ PRKG1-signaling is involved in the regulation of pnx1 in RBCs. Carbenoxolone, which is an inhibitor of pnx1, significantly increases the fluorescent signal within RBCs. Inhibition of NOS and PRKG1 mimic the effect of carbenoxolone. The treatment of RBCs with 8-bromo-cGMP significantly decreases the fluorescent signals within RBCs in a dose dependent manner. Summary The present work reveals that adult, human RBCs carry a sGC and a PRKG1. Both proteins are an integral part of the eNOS signaling cascade within RBCs. They significantly contribute to deformability at low levels of shear stress. Furthermore results presented here provide evidence that eNOS signaling is involved in the regulation of pnx1 in RBCs.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	14.09.2017
Dateien geändert am:	14.09.2017
Promotionsantrag am:	16.12.2016
Datum der Promotion:	12.09.2017