Dokument: Structure-based studies on LOV photoreceptor proteins
| Titel: | Structure-based studies on LOV photoreceptor proteins | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43434 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20191031-091039-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Arinkin, Vladimir [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Batra-Safferling, Renu [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD Dr. Heberle, Joachim [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | LOV proteins, LOV Histidine Kinase, flavin chromophore, blue light photoreceptor, optical tool, optogenetics, Pseudomonas | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Proteins containing blue-light absorbing light-oxygen-voltage (LOV) domains participate in a multitude of cellular responses in both eukaryotes and prokaryotes. LOV domains bind non-covalently ubiquitous flavins (e.g. flavin mononucleotide), which are responsible for the blue-light absorption. The primary photochemistry of blue-light absorption contains several intermediate states that lead to the formation of covalent adduct between flavin and highly conserved cysteine residue. The state with formed covalent adduct, referred as the light state, is stable on the wide range of time scales, ranging from seconds to hours. The light state, spontaneously, recovers back to the initial ground state (the dark state) with the characteristic time constant (the adduct lifetime).
Although LOV domains usually form a part of multi-domain protein that contains an effector domain, a considerable number of LOV domains (short LOV proteins) were identified as single proteins, which lacks any additional domains. The physiological role of only a few short LOV proteins, from fungi and bacteria, could be assigned. In this thesis, the results are presented on short LOV proteins (PpSB2-LOV, SBW25-LOV, Pf5-LOV and W619_1-LOV) from plant and soil colonizing bacteria Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens. They show considerable variation of the adduct lifetime, from minutes to even days. Their crystal structures were obtained in the dark and light states. Analysis of the structures revealed the correlation between the adduct lifetime and the cavity volume of the chromophore binding pocket. Molecular dynamic simulations supported the hypothesis that decrease of the solvent accessibility to the flavin chromophore decelerates the dark recovery. Structural elements, which surround the chromophore binding pocket, were found to be more flexible in proteins with the short adduct lifetime and more rigid in proteins with the long adduct lifetime. Short LOV proteins of this study contain non-canonical N- and C-terminal extensions, beside the conserved core domain. Such extensions are similar to the typical linker between domains of sensory multi-domain proteins. Often N- and C-terminal extensions form α-helix, which is generally well suitable for mechanical signal transduction. This makes short LOV proteins a prototype system to study not only the signal propagation within LOV domains but also the signal transduction from the LOV domain to the potential effector domain. Analysis of crystal structures from this work together with previously determined crystal structures of homologous protein PpSB1-LOV, in the dark and light states, revealed the primary structural changes induced by light. The primary structural changes originate from the formation of covalent adduct between cysteine and flavin-C4a atom, and from the protonation of the flavin-N5 atom. Both events results in the conformational changes of Leu97 and Gln116 residues, which induce further changes in the β-scaffold of the core domain and in the N-terminal α-helix. Altered interactions in the β-scaffold and in the N-terminal α-helix, which largely participate in the dimer interface, result in the rotation of monomers relative to each other. This rotation, thereafter, result in the movement of the C-terminal α-helices, which conceivably can alter the conformation or dynamics of a fused effector domain in a multi-domain protein. The crystal structure of W619_1-LOV determined in this work is the first structure of LOV domain in the apo form, free of any bound flavin. The structure of W619_1-LOV in the apo form showed changes of the chromophore binding pocket, compared to the FMN-bound structure of homologous PpSB1-LOV protein. Major changes happened in the two α-helices connected by a long loop, which partially form the chromophore binding pocket. Furthermore, the apo form of W619_1-LOV was stable in solution and was loaded in vitro with natural flavins: flavin mononucleotide (FMN), riboflavin (RBF), flavin adenine dinucleotide (FAD) and lumichrome (LC); and with modified flavins: 7-bromo-riboflavin (7-Br-RF) and 8-chloro-riboflavin (8-Cl-RF). Binding of different flavins to W619_1-LOV significantly altered their biophysical and biochemical properties, such as UV-Vis absorbance and fluorescence spectra. Among them, the LC bound to W619_1-LOV has demonstrated remarkable blue-shift of the absorption maximum of 26 nm when compared to the FMN-bound maximum. The LC bound to W619_1-LOV also showed relatively high fluorescence quantum yield of 0.4. The adduct lifetime considerably varied among different flavins, indicating the importance of specific chromophore-to-protein interactions on the kinetics of dark recovery. For instance, the RBF-bound W619_1-LOV has the adduct lifetime 307 times faster than those of the FMN-bound (1.5 min vs 460 min at 20 °C). Another notable property was found that 8-Cl-RF, forms a covalent bond between the 8-Cl atom and the conserved Cys53 in the binding pocket. The resulting LOV protein provides unique opportunity for its application as an optical tool. LOV containing histidine kinases (LOV-HK) are the most abundant two component signaling system in bacteria among the LOV containing multi-domain proteins. The SB1F1 and SB2F1 are two engineered LOV-HK, which were previously constructed in the similar fashion as known from the literature YF1 protein. For this, the oxygen-sensitive PAS domain in the histidine kinase FixL from Bradyrhizobium japonicum was replaced to the LOV domains of PpSB2-LOV or PpSB1-LOV proteins from Pseudomonas putida. The SB1F1 protein crystals resulted in diffraction data that failed to be sufficiently phased. However, several crystal structures of dimeric SB2F1 in the different states and with different nucleotides (ATP, ADP, AMP-PNP, ATP-γ-S) are presented here. Additionally, the small-angle X-ray scattering (SAXS) data enabled to relate the states observed in solution to the different crystal structures of SB2F1. Analysis of SB2F1 data and comparison to previously determined YF1 structure, suggested large-scale quaternary structural changes upon blue-light illumination. The mechanism of signal transduction from the LOV domain to the histidine kinase is in good agreement with that proposed for the short LOV proteins in this work. In brief, after formation of the light state, LOV domains rotate relative to each other, which results in the rearrangement of long and helical DHp domain (dimerization and histidine phosphotransfer) of HK. The rearrangement of the coiled-coil-like DHp domains, alters the spatial arrangement of the CA domains (catalytic and ATP binding). Different spatial arrangement of CA domains, in turn, can result in the different autophosprylation rates in the light and dark states. Additional experiments in future are required to prove this hypothesis and elucidate additional details of this mechanism.Proteine mit Blaulicht-absorbierenden Light-Oxygen-Voltage (LOV) Domänen sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse sowohl in Eukaryonten als auch in Prokaryonten involviert. LOV-Domänen binden nicht kovalent ubiquitäre Flavine (z.B. Flavinmononukleotid), die für die Blaulichtabsorption verantwortlich sind. Die primäre Photochemie der Blaulichtabsorption besteht aus mehreren Übergangszuständen, die u.a. zur Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Flavin und einem konserviertem Cystein führen. Dieser sogenannte Lichtzustand kann von Sekunden bis hin zu Stunden stabil sein und geht nach einer charakteristischen Adduktlebensdauer (mit spezifischer Zeitkonstante) spontan wieder in den Dunkelzustand (dem Grundzustand) über. LOV-Domänen können einzeln als sog. kurze LOV-Proteine aber auch Bestandteil von Mehrdomänen-Proteine sein, letztere werden durch zusätzliche Effektor-Domäne ergänzt. Die physiologische Rolle nur weniger kurzer LOV-Proteine etwa aus Pilzen und Bakterien sind bekannt. In dieser Arbeit werden u.a. Ergebnisse kurzer LOV-Proteine (PpSB2-LOV, SBW25-LOV, Pf5-LOV und W619_1-LOV) aus Pflanzen- und Bodenkolonisierungsbakterien (Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens) präsentiert. Sie zeigen eine beträchtliche Variation in der Adduktlebensdauer. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnten die Kristallstrukturen von verschiedenen Lichtanregungszuständen aufgeklärt werden. Die Strukturanalyse ermöglichte es eine Korrelation zwischen der Adduktlebensdauer und dem Volumen der Chromophor-Bindungstasche nachzuweisen. Molekulardynamische Simulationen unterstützen diese Hypothese, dass eine Verringerung der Lösungsmittelzugänglichkeit zum Flavin-Chromophor die Rückkehr zum Dunkelzustand verlangsamt. Strukturelemente, die die Chromophor-Bindungstasche umgeben, sind in Proteinen mit einer schnellen Adduktlebensdauer flexibler und in Proteinen mit einer langsamen Adduktlebensdauer rigider. Die hier untersuchten kurzen LOV-Proteine enthalten nicht-kanonische N- und C-terminale Strukturelemente zusätzlich zu der konservierten Kerndomäne. Solche Erweiterungen ähneln den typischen Linker-Domänen in den sensorischen Mehrdomänen-Proteinen. Oft bestehen diese N- und C-terminale Erweiterungen aus α-Helices, die als Teil der mechanischen Signaltransduktion dienen können. Dies macht kurze LOV-Proteine zu einem Referenz-System, für Untersuchungen der Signalausbreitung innerhalb der LOV-Domänen, sowie der Signalweiterleitung zur potentiellen Effektor-Domäne. Der Vergleich der Kristallstrukturen aus dieser Arbeit mit den Kristallstrukturen des homologen Proteins PpSB1-LOV (s. Literaturdaten), in ihren Dunkel- und Lichtzuständen, zeigen Struktur- und Konformationsänderungen die durch die Belichtung induziert werden. Die ersten Veränderungen ergeben sich aus der Bildung der kovalenten Bindung zwischen dem konservierten Cystein und dem C4a-Atoms des Flavins und aus der Protonierung des N5-Atoms. Beide Ereignisse führen zu Konformationsänderungen der Leu97- und Gln116-Seitenketten, die weitere Veränderungen in den β-Faltblättern der Kerndomäne sowie in der N-terminalen α-Helix nach sich ziehen. Veränderte Wechselwirkungen in den β-Faltblättern und der N-terminalen α-Helix, die weitgehend an der Dimer-Grenzfläche beteiligt sind, führen zu einer Drehung der Monomere relativ zueinander. Diese Rotation initiiert eine Bewegung der C-terminalen α-Helices, die zum Beispiel die Konformation bzw. Dynamik einer fusionierten Effektor-Domäne in einem Mehrdomänen-Proteinen verändern könnte. Die in dieser Arbeit untersuchte Kristallstruktur von W619_1-LOV zeigt die LOV-Domäne erstmals in der Apo-Form, also Flavin-frei. Es sind Änderungen in der Chromophor-Bindungstasche im Vergleich zur der Flavinmononukleotid-gebundenen Struktur des homologen PpSB1-LOV-Proteins zu beobachten. Im Wesentlichen betrifft dies zwei α-Helices, die teilweise die Chromophor-Bindungstasche ausbilden. Die Apo-Form von W619_1-LOV ist in Lösung stabil und wurde in vitro mit natürlichen Flavinen beladen: Flavinmononukleotid, Riboflavin, Flavin-Adenindinukleotid und Lumichrom; sowie mit folgenden modifizierten Flavinen: 7-Brom-Riboflavin und 8-Chlor-Riboflavin. Die Bindung der verschiedenen Flavine an W619_1-LOV verändert die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften, wie z.B. das jeweilige UV-Vis- und Fluoreszenzspektrum. Wenn z.B. Lumichrom gebunden ist, kommt es zu einer signifikanten Blauverschiebung, das Absorptionsmaximum ist um 26 nm geschiftet im Vergleich mit dem Absorptionsmaximum bei Bindung von Flavinmononukleotid. Das gebundene Lumichrom zeigte zudem eine erhöhte Fluoreszenzquantenausbeute. Die Adduktlebensdauer variiert stark zwischen den verschiedenen Flavinen. Die spezifischen Chromophor-Protein-Wechselwirkungen haben Einfluss auf die Kinetik der Rückkehr zum Dunkelzustand. Zum Beispiel hat das Riboflavin-gebundene W619_1-LOV eine 307-fache kurzlebigere Adduktlebensdauer als der Flavinmononukleotid-gebunden W619_1-LOV (1,5 min verglichen mit 460 min bei 20 °C). Weiterhin ist bemerkenswert, dass 8-Chlor-Riboflavin eine kovalente Bindung zwischen dem Cl-Atom und dem konserviertem Cystein in der Bindungstasche ausbildet. Die am häufigsten vorkommenden Zweikomponenten-Signaltransduktionssysteme in Bakterien sind Kombinationen von LOV-Domänen mit Histidinkinasen (HK). SB2F1 und SB1F1 sind zwei artifiziell konstruierte LOV-HK, die in ähnlicher Weise wie das aus der Literatur bekannte YF1 Protein konstruiert wurde. Hierzu wird die sauerstoffempfindliche PAS-Domäne der Histidinkinase FixL aus Bradyrhizobium japonicum durch die LOV-Domäne des PpSB2-LOV-Proteins bzw. des PpSB1-LOV-Proteins aus Pseudomonas putida fusioniert. Verschiedene Varianten von SB2F1-Kristallstrukturen wurden in dieser Arbeit aufgeklärt. Dies schließt unterschiedliche Lichtanregungszustände sowie verschiedene Nukleotidbeladungen (ATP, ADP, AMP-PNP, ATP-γ-S) mit ein. Zusätzliche Messungen von Kleinwinkelröntgenstreuungs-Daten in Lösung ermöglichten es, die unterschiedlichen Zustände, den verschiedenen Kristallstrukturen von SB2F1 zuzuordnen. Die Analyse der SB2F1-Daten und der anschließende Vergleich mit YF1 lässt Rückschlüsse auf die Gründe für die globalen Veränderungen in der Quartärstruktur bei Blaulicht-Einstrahlung zu. Die Signaltransduktion von der LOV-Domäne zur Histidinkinase ist vergleichbar mit dem in dieser Arbeit vorgeschlagene Mechanismus für kurze LOV-Proteine. Zusammengefasst sind folgende Strukturänderungen zu beobachten, nach Bildung des Lichtzustandes drehen sich die LOV-Domänen relativ zueinander, was zur Umlagerung der langen helikalen DHp-Domänen (dimerization and histidine phosphotransfer) der Histidinkinase führt. Diese Verschiebung der Coiled-coil-artigen DHp-Domäne ändert dann die räumliche Anordnung der CA-Domänen (catalytic and ATP binding). Die neupositionierten CA-Domänen können dann wiederum zu verschiedenen Autophosphorylierungsraten der Dunkel- bzw. Lichtzustände führen. Zusätzliche Experimente werden erforderlich sein, um diese Hypothese zu überprüfen und auch weitere Details der Signaltransduktion aufzuklären. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 31.10.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 31.10.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.07.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 30.06.2017 |
