Dokument: Enzymatic Transamination: (R)-Selective omega-Aminotransferases for the Production of Enantiomerically Pure Amines

Titel:	Enzymatic Transamination: (R)-Selective omega-Aminotransferases for the Production of Enantiomerically Pure Amines
Weiterer Titel:	Enzymatische Transaminierung: (R)-selektive omega-Aminotransferasen für die Produktion von enantiomerenreinen Aminen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43421
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171005-094601-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Herring, Linda [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.09.2017 / geändert 12.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	aminotransferase, transaminase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	ω-Transaminases open the access to a broad variety of chiral amines. The main purpose of this work was the identification of new (R)-selective ω-transaminases. Another key aspect was the characterisation of the new candidates concerning their substrate spectra and their activity with bulky substrates. These studies should demonstrate the ability of these enzymes to produce different chiral amines and give an insight into their two-binding active site. For the identification of novel (R)-selective ω-transaminases, two rounds of an in silico screening were done. The sequences of the (R)-selective transaminases from Mesorhizobium loti MAFF303099 and Arthrobacter sp. KNK168 were used as query sequences in protein alignments (BLAST = Basic Local Alignment Search Tool) against the NCBI database. Altogether, thirteen proteins (whereof one was from metagenome sequences) were chosen for expression in E. coli. Four proteins showed transaminase activity and also the protein from metagenome sequences could be identified as a transaminase after refolding from inclusion bodies. The expression studies with the transaminases showed an increased activity upon addition of the cofactor pyridoxal-5’-phosphate (PLP) to the culture medium. To reduce the list of candidates, the identified enzymes were compared to literature known ω-transaminases. Most ω-transaminases described in literature have phenylalanine at position 95 of the sequence motif postulated by Höhne et al . and appear to be more active than ω-transaminases with tyrosine at this position. Being the most promising candidates, the two ω-transaminases with Phe (R-FPTA) and Tyr (R-TRTA) at position 95 were studied in detail. For screening of the ω-transaminase activity, gas chromatographic and spectrophotometric assays were used. To enable a comparison of the initial amination and deamination activities, the handling and composition of the existing assays were optimized. Besides different amino acids at the key position 113 (= position 95 in the sequence motif), the ω-transaminases R-TRTA and R-FPTA showed differences in their biochemical characteristics. With pH optima at pH 9 and pH 7.5 both lay in the typical pH range of transaminases. Of these two, R-TRTA had higher temperature stability. The activity of R-FPTA was already significantly reduced after incubation at 30 °C and nearly completely lost after incubation at 41.2 °C, whereas R-TRTA showed still 50% activity after incubation at 41.2 °C. The higher temperature stability of R-TRTA is at expense of a lower activity. The catalytic parameters of R-FPTA (Vmax=797.92±8.13mU/mg and Km=0.28±0.05mM) resembled a much higher activity with 1-phenylethylamine 1a compared to R-TRTA (Vmax=241.80±4.70mU/mg, Km=4.43±0.12mM). R-TRTA had its highest activities with bulky substrates. Furthermore, it showed a broader activity range compared to R-FPTA, which indicated a higher variation of the substrate spectrum of R-TRTA. R-FPTA showed a more balanced substrate spectrum than R-TRTA with a preference for the aliphatic and therefore more flexible substrates. Additionally, more detailed insights into the active site of R-TRTA were gained by solving the crystal structure of this ω-transaminase. Site-directed mutagenesis was performed at position 113 between the large and small bindig pocket, using a degenerated NNK codon. From the following screening two variants were chosen for each ω-transaminase. Since it was presumed that ω-transaminases with phenylalanine (Phe) at position 113 (R-FPTA) are more active than ω-transaminases with tyrosine (Tyr, R-TRTA) at this position, variants of R-FPTA and R-TRTA where Phe was replaced by Tyr and vice versa, were part of the chosen variants. The variants R-TRTA_C-His Y113F, R-TRTA_C-His Y113R, R-FPTA_C-His F113Y and R-FPTA_C-His F113M E115K were characterized. Besides the influence on the substrate spectrum by changes in the size of the binding pocket and polarity of the amino acids, the mutations had also an influence on the pH optima. The changes of R-TRTA lead to a lower pH optimum and a lower acceptance of large substrates. In R-FPTA, the changes induced a shift of the pH optimum to higher pH values and caused a higher preference for larger substrates. It is presumed that the change of the amino acid at position 113 alters the interaction of the amino acids which are responsible for the substrate binding. The initial presumption that (R)-selective ω-transaminases with Phe at position 113 are more active compared to ω-transaminases with Tyr at this position was confirmed by R-TRTA and R-FPTA. It was also shown that the hydroxyl group of Tyr seems to be important for certain substrates, in particular 4-phenyl-2-butanone 2c. The possibility to build hydrogen bonds between the position 113 and the substrate could be more important for substrate selectivity than the overall size of the amino acid, which was shown for R-TRTA_C-His Y113R. In the particular case of the substrate 2-tetralone 2f, the enantioselectivity was improved from 65% ee to 95% ee with the R-TRTA_C-His Y113F variant. Altogether, the new (R)-selective ω-transaminases R-TRTA and R-FPTA are potent and tunable biocatalysts. Whereas R-FPTA is more active, R-TRTA is more stable. The mutagenesis of both ω-transaminases on a small scale showed that these enzymes can be optimized for certain pH optima and the substrate spectrum can be influenced by minor alteration in their binding pockets. Therefore, they are suitable for versatile reactions and accommodate the increasing demand of amination catalysts. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung neuer (R)-selektiver ω-Transaminasen. Ein weiterer Schwerpunkt war die Charakterisierung der neuen Kandidaten bezüglich ihrer Substratspektren allgemein und insbesondere ihre Aktivität mit sperrigen Substraten. Diese Studien sollten die Fähigkeit dieser Enzyme zur Produktion verschiedener chiraler Amine darstellen und einen Einblick in ihr zwei-bindiges aktives Zentrum geben. Für die Identifizierung der neuen (R)-selektiven ω-Transaminasen wurden zwei Runden eines in silico Screenings durchgeführt. Die Sequenzen der (R)-selektiven Transaminasen aus Mesorhizobium loti MAFF303099 und Arthrobacter sp. KNK168 wurden als Suchsequenzen in Protein-Alignments (BLAST = Basic Local Alignment Search Tool) gegen die NCBI-Datenbank eingesetzt. Insgesamt wurden 13 Proteine für die Expression in E. coli ausgewählt (davon eines aus Metagenom-Sequenzen). Vier dieser Proteine zeigten Transaminaseaktivität, und auch das Protein aus Metagenom-Sequenzen konnte nach der Rückfaltung aus Inclusion Bodies als Transaminase identifiziert werden. Die Expressionsstudien der Transaminasen zeigten nach Zugabe des Cofaktors Pyridoxal-5’-phosphat (PLP) zum Kulturmedium höhere Aktivitäten. Um die Kandidatenliste weiter einzugrenzen, wurden die identifizierten Enzyme mit literaturbekannten ω-Transaminasen verglichen. Die meisten der in der Literatur beschriebenen ω-Transaminasen besitzen Phenylalanin (Phe) an der Position 95 des von Höhne et al . postulierten Sequenzmotivs und scheinen aktiver zu sein als ω-Transaminasen mit Tyrosin (Tyr) an dieser Position. Aufgrund dieses Unterschieds, und da sie sich als vielversprechende Kandidaten herausstellten, wurden zwei ω-Transaminasen mit Phe (R-FPTA) beziehungsweise Tyr (R-TRTA) an der Position 95 weiter untersucht. Für das Screening der ω-Transaminase-Aktivität wurden gaschromatographische und spektrophotometrische Tests genutzt. Um einen Vergleich der initialen Aminierungs und Desaminierungsaktivitäten zu ermöglichen wurde neben der Handhabung auch die Zusammensetzung der vorhandenen Tests optimiert. Neben den unterschiedlichen Aminosäuren an der Schlüsselposition 113 (= Position 95 im Sequenzmotiv), zeigten die ausgewählten ω-Transaminasen R-TRTA und R-FPTA Unterschiede in ihren biochemischen Eigenschaften. Mit pH-Optima bei pH 9 und pH 7,5 lagen beide in dem für Transaminasen typischen Bereich. Von beiden hatte R-TRTA eine höhere Temperaturstabilität. R-FPTA wies bereits nach der Inkubation bei 30 °C eine signifikant geringere Aktivität auf und war nach der Inkubation bei 41,2 °C nahezu inaktiv. R-TRTA zeigte dagegen nach der Inkubation bei 41,2 °C immer noch 50% der ursprünglichen Aktivität. Die höhere Temperaturstabilität von R-TRTA geht auf Kosten einer geringeren Aktivität. Die katalytischen Parameter von R-FPTA (Vmax=797.92±8.13mU/mg und Km=0.28±0.05mM) entsprechen im Vergleich zu R-TRTA (Vmax=241.80±4.70mU/mg, Km=4.43±0.12mM) einer deutlich höheren Aktivität mit 1-Phenylethylamin 1a. R-TRTA zeigte die höchsten Aktivitäten mit sperrigen Substraten. Darüber hinaus wies dieses Enzym im Vergleich zu R-FPTA größere Unterschiede in der Aktivität auf, was auf ein breiteres Substratspekrum von RTRTA hinweist. R-FPTA zeigte ein ausgewogeneres Substratspektrum als R-TRTA mit einer Präferenz für aliphatische und daher flexiblere Substrate. Durch die Aufklärung der Kristallstruktur von R-TRTA wurden zudem genauere Einblicke in das aktive Zentrum dieser ω-Transaminase gewonnen. An der Position 113 wurde zwischen der großen und kleinen Bindetasche eine ortsspezifische Mutagenese mittels eines degenerierten NNK-Codons durchgeführt. Aus dem darauffolgenden Screening wurden zwei Varianten jeder ω-Transaminase ausgewählt. Da angenommen wurde, dass ω-Transaminasen mit Phe an der Position 113 (R-FPTA) aktiver sind als ω-Transaminasen mit Tyr (R-TRTA) an dieser Position, wurden Varianten von R-FPTA und R-TRTA mit der jeweils anderen Aminosäure ausgewählt. Es wurden die Varianten R-TRTA_C-His Y113F, R-TRTA_C-His Y113R, R-FPTA_-C-His F113Y und R-FPTA_C-His F113M E115K untersucht. Neben dem Einfluss auf das Substratspektrum durch Änderungen in der Größe der Bindungstasche und der Polarität hatten die Mutationen Einfluss auf die pH-Optima. Die Änderungen in R-TRTA führten zu niedrigerem pH-Optimum und einer geringeren Akzeptanz großer Substrate. In R-FPTA induzierten die Änderungen eine Verschiebung des pH-Optimums zu höheren pH-Werten und verursachten eine höhere Präferenz für große Substrate. Es wird angenommen, dass der Austausch der Aminosäuren an Position 113 die Wechselwirkung der Aminosäuren auslöst, die für die Substratbindung verantwortlich sind, beeinflusst. Die ursprüngliche Annahme, dass (R)-selektive ω-Transaminasen mit Phe an der Position 113 aktiver sind als ω-Transaminasen mit Tyr an dieser Position, wurde mit R-TRTA und R-FPTA bestätigt. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Hydroxylgruppe von Tyr für bestimmte Substrate wichtig zu sein scheint, insbesondere für 4-Phenyl-2-butanon 2c. Die Möglichkeit, Wasserstoffbrückenbindungen ausgehend von der Position 113 zum Substrat auszubilden, könnte wichtiger für die Substratselektivität sein als die Größe der Aminosäure, was mit R-TRTA_C-His Y113R gezeigt wurde. In dem speziellen Fall vom Substrat 2-Tetralon 2f wurde die Enantioselektivität mit R-TRTA_C-His Y113F von 65% ee auf 95% ee verbessert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die neuen (R)-selektiven ω-Transaminasen R-TRTA und R-FPTA potente und anpassbare Biokatalysatoren sind. Dabei ergänzen sich die Eigenschaften beider ω-Transaminasen bezüglich Aktivität und Stabilität. Die Einführung von Punktmutationen zeigte, dass diese Enzyme für bestimmte pH-Optima optimiert werden können und dass das Substratspektrum durch geringfügige Änderungen innerhalb der Bindungsstaschen beeinflusst werden kann. Daher sind sie für vielfältige Reaktionen geeignet und können so die steigende Nachfrage an Aminierungskatalysatoren erfüllen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	05.10.2017
Dateien geändert am:	05.10.2017
Promotionsantrag am:	12.06.2017
Datum der Promotion:	05.07.2017