Dokument: Rhodobacter capsulatus als alternativer Wirt zur Produktion pflanzlicher Sesquiterpenoide

Titel:	Rhodobacter capsulatus als alternativer Wirt zur Produktion pflanzlicher Sesquiterpenoide
Weiterer Titel:	Rhodobacter capsulatus an alternativ host for the production of plant sesquiterpenoids
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43263
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170904-114820-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Troost, Katrin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,40 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.09.2017 / geändert 04.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Rhodobacter capsulatus, Produktion, Terpenoid
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Terpenoide gehören zu einer der größten Gruppen von Sekundärmetaboliten, die aufgrund vielfältiger bioaktiver und therapeutischer Eigenschaften bedeutsam für die Pharma-, Kosmetik- und auch Lebensmittelindustrie sind. Die Herstellung von Terpenoiden in ihren natürlichen Produzenten erfolgt oft nur in geringen Mengen, sodass durch Extraktion typischerweise nur sehr geringe Ausbeuten erzielt werden. Neben der schwierigen und teuren chemischen Synthese kann die heterologe Produktion in Mikroorganismen dem gegenüber eine ökonomische und ökologische Alternative darstellen. Das fakultativ phototrophe Bakterium R. capsulatus stellt natürlicherweise Carotinoide (Tetraterpenoide) in hohen Mengen her, deren Vorstufen über den DXP-Biosyntheseweg bereitgestellt werden. Im Vergleich mit anderen etablierten Wirten stellt das Bakterium einen bislang weniger untersuchten Produktionswirt dar. Aufgrund seiner spezifischen Physiologie unter phototrophen Bedingungen ist er allerdings eine vielversprechende Alternative. Das Ziel dieser Arbeit war daher, am Beispiel der Patchoulolsynthase aus dem indischen Patchouli Pogostemon cablin systematisch zu evaluieren, ob es möglich ist, in R. capsulatus wirtsfremde Terpenoide zu produzieren. Darüber hinaus wurden verschiedene spezifische metabolic engineering-Strategien entwickelt und ihre Anwendung in R. capsulatus im Hinblick auf die Steigerung der Terpenoidproduktion evaluiert. Es konnte festgestellt werden, dass die Produktion wirtsfremder Sesquiterpene (i) durch Coexpression von IspA und Verwendung einer ΔcrtE-Mutante, sowie (ii) durch die Steigerung der Isoprenoidbiosynthese sowohl mittels Coexpression der bekannten DXP-Weg-limitierenden Enzyme DxS und Idi als auch (iii) durch den Transfer des MVA-Wegs aus Paracoccus zeaxanthinifaciens in R. capsulatus gesteigert werden konnte. Dabei stellte sich die R. capsulatus Mutante SB1003+MVA mit plasmidbasierter Coexpression von ispA, dxs und idi als besonders erfolgreich heraus. Mit diesem Stamm konnte die Patchoulolausbeute gegenüber dem Ausgangsstamm um das 112-fache gesteigert werden und führte zu dem höchsten bislang publizierten Produkttiter von 66,3 mg/l. Da ein ganzes Set an Expressionsvektoren für R. capsulatus erzeugt wurde, durch die verschiedene engineering-Strategien an unterschiedlichen Stellen der Terpenbiosynthese verfolgt werden können, steht somit für zukünftige Studien und Anwendungen eine toolbox zur Verfügung, um die Produktion von verschiedensten wirtsfremden Terpenoiden zu steigern. Es konnte die allgemeine Anwendbarkeit des Expressionswirts und verschiedener engineering-Maßnahmen auf die Produktion anderer Terpenoide am Beispiel von zwei unterschiedlich aktiven Valencensynthasen aus der Nootka-Scheinzypresse Callitropsis nootkatensis und der Orange Citrus sinensis bestätigt werden. Dabei stellte sich heraus, dass vermutlich die katalytische Effizienz der Terpensynthase bei der Wahl der engineering-Strategie entscheidend ist, da eine zu effiziente Bereitstellung der Isopren-Vorstufen möglicherweise zu inhibitorischen Effekten in dem rekombinanten Sesquiterpenbiosyntheseweg führen kann. Durch die vergleichende Evaluierung der verschiedenen metabolic engineering Strategien konnte für die Valencensynthase aus C. nootkatensis so ein R. capsulatus Stamm erzeugt werden, der im Vergleich zum Wildtyp eine um das 255-fache gesteigerte Valencenausbeute von 324 mg/l aufwies. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass R. capsulatus ein vielversprechender alternativer Wirt für die nachhaltige Produktion wirtsfremde Terpenoiden ist. Die besonderen physiologischen Eigenschaften und die erzeugten Expressionvektoren, durch die an verschiedenen Stellen metabolic engineering angewendet werden kann, machen das phototrophe Bakterium zu einem vielversprechenden Plattformorganismus für die Produktion und Charakterisierung neuer und biotechnologisch relevanter Terpenoide. Terpenoids belong to one of the largest group of secondary metabolites that are of interest for the pharmaceutical, cosmetics as well as the food industry due to their bioactive and therapeutic properties. Typically, terpenoids are produced in low quantities by organisms so that extraction of terpenoids from their natural sources oftentimes results in low yields of product. The heterologous production of terpenoids in microbial platforms may present a cost-effective and ecological alternative to the costly and complicated production of terpenoids by chemical synthesis. The facultative phototrophic bacterium R. capsulatus is naturally capable of producing high quantities of carotenoids (tetraterpenoids) using the DXP pathway for precursor biosynthesis. In contrast to more established microbial platforms R. capsulatus presents a production host that has not been explored to a great extent so far. However, owing to a special physiology under phototrophic conditions the organism presents a promising alternative to other platforms. For this reason the aim of this thesis was to systematically evaluate the feasibility of producing non-native terpenoids in R. capsulatus by using the example of the patchoulol synthase from the Indian patchouli Pogostemon cablin. Additionally, different metabolic engineering strategies were developed and their application in R. capsulatus evaluated with regard to the increase in terpenoid production. It could be asserted that the production of non-native sesquiterpenes in R. capsulatus was increased by (i) co-expression of IspA and using a R. capsulatus ΔcrtE-mutant (ii) increasing the isoprenoid biosynthesis by co-expression of genes encoding enzymes DxS and Idi which are known to be limiting factors for isoprenoid production in the DXP pathway as well as (iii) transfer of the mevalonic acid pathway from Paracoccus zeaxanthinifaciens. Using the R. capsulatus mutant strain SB1003+MVA in combination with plasmid-based co-expression of ispA, dxs and idi proved to be especially successful. Compared to the original strain that was used as a starting point, the yield of patchoulol production could be increased by a factor 112 using this strain, ultimately resulting in yields corresponding to 66.3 mg/l patchoulol, the highest production yield that has been published yet. Due to the fact that a whole set of different expression plasmids was developed for R. capsulatus, different engineering strategies targeting different steps of terpenoid biosynthesis may be pursued, so that for future studies and applications a toolbox for increasing the production of different non-native terpenoids is readily available. The general applicability of R. capsulatus as an expression host as well as the application of different engineering procedures in the host for the production of other non-native terpenoids could be shown. This was accomplished by using the examples of two differently active valancene synthases, one from Nootka Cypress Callitropsis nootkatensis and the other from the orange fruit Citrus sinensis respectively. It was determined that the catalytic efficiency of the respective enzyme is probably a determinative factor for the selection of the right engineering strategy, as too efficient a supply of Isoprenoid-precursors might possibly be resulting in inhibitory effects on the recombinant biosynthesis pathway of the sesquiterpene in this expression host. By comparative evaluation of the application of different metabolic engineering strategies for the valancene synthase from C. nootkatensis a R. capsulatus production strain could be engineered that was characterized by a valencene yield of 324 mg/l which reflects an increase factor of valencene yield by 255 compared to the wild type strain. In the scope of this thesis it could be shown that R. capsulatus is a promising alternative host for the sustainable production of non-native terpenoids. The special physiological characteristics of the organism and the developed set of expression plasmids, that allow for targeting different steps of the biosynthesis pathways by way of metabolic engineering, make the phototrophic bacterium R. capsulatus a promising platform organism for the production and characterisation of novel and biotechnologically relevant terpenoids.
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Bezug:	IMET, Forschungszentrum Jülich, März 2014 bis Juni 2017
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	04.09.2017
Dateien geändert am:	04.09.2017
Promotionsantrag am:	07.06.2017
Datum der Promotion:	18.07.2017