Dokument: Strukturelle Untersuchung von Protein-Membran Interaktionen mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie

Titel:	Strukturelle Untersuchung von Protein-Membran Interaktionen mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie
Weiterer Titel:	Structural Investigation of Protein-Membrane Interactions with Solid-State NMR Spectroscopy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43247
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170904-084819-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Beumer, Claudia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.08.2017 / geändert 25.08.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Heise, Henrike [Betreuer/Doktorvater] PD. Dr. König, Bernd [Gutachter]
Stichwörter:	Festkörper NMR Spektroskopie, Nitrophorin 7, NP7, Virales Protein U, VpU, Protein-Membran Interaktion, NMR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Virale Protein U (VpU) ist ein akzessorisches Membranprotein von HIV-1. Infolge der HIV-1 Infektion spielt es eine wichtige Rolle in der Umgehung der Immunantwort des Wirts und unterstützt die Ausbreitung des Virus. Zum genaueren Verständnis dieser Mechanismen ist die strukturelle Untersuchung von VpU von großer Bedeutung. Zur strukturellen Untersuchung von Membranproteinen in naturnaher Umgebung eignen sich insbesondere Festkörper-NMR- und DNP-NMR-Spektroskopie. Um ausreichende Mengen des Proteins für spektroskopische Untersuchung zu generieren, wurde zunächst die Herstellung von VpU optimiert. Dazu wurde ein neues Codon-optimiertes VpU-Konstrukt mit einem kürzeren N-terminalen Überhang kloniert und die Expression in Minimalmedium optimiert. Zudem wurden erste DNP-NMR-Experimente an VpU in Liposomen durchgeführt. Dazu wurde die Probenzusammensetzung bezüglich der Radikal- und der Glycerinkonzentration optimiert und ein erstes 2D Spektrum aufgenommen, dass eine hohe Übereinstimmung mit konventionellen Festkörper-NMR-Spektren des Proteins aufwies. Das 21 kDa große Protein Nitrophorin 7 (NP7) gehört zu einer Klasse von Häm-bindenenden Proteinen im Speichel des blutsaugenden Insekts Rhodnius prolixus. Es bindet reversible Nitroxid (NO), welches während der Blutmahlzeit infolge einer pH-Wert Änderung vom Insektenspeichel (pH 5 6) zum Blut des Wirtes (pH 7,4) wieder freigesetzt wird. NO wirkt als Vasodilator und Koagulationsinhibitor. Die Signifikanz von NO in der kardiovaskulären Regulation veranlasste zur Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Speicherung und zum Transport von NO in natürlich vorkommenden NO-Transportsystemen, wie den Nitrophorinen. NP7 unterscheidet sich von den anderen Isoformen durch die Möglichkeit an negativ geladene Membranen zu binden. Zudem oligomerisiert es in höheren Konzentrationen. Daher wurde der Einfluss der Membraninteraktion von NP7 auf dessen Struktur mit Hilfe von Festkörper-NMR-Spektroskopie untersucht. Es wurde revers isotopenmarkiertes NP7 hergestellt und an Liposomen gebunden, die bezüglich ihrer Größe, der Lipidkopfgruppe und des Lipid-zu-Protein Verhältnisses optimiert wurden. In NMR-Spektren konnte eine reverse Isotopenmarierungseffizienz der NP7 NMR-Proben von 97 98 % festgestellt werden. Es war eine Aminosäuretyp-spezifische Resonanzzuordnung von 40 - 55 % der Aminosäuren des Proteins in den verschiedenen NMR-Proben möglich. Zudem wurden einzelne sequentielle Resonanzzuordnungen erhalten. Ein Vergleich mit einer vorhandenen NP7 Kristallstruktur ließ vermuten, dass der Großteil des Proteins in den NMR-Spektren sichtbar ist. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Liposomenbindung des Proteins die Gesamtfaltung des Proteins nicht beeinflusst. Es wurde eine mögliche strukturelle Beeinflussung des Threonins T163 durch die Membranbindung ausgemacht. Es konnte zudem eine Verringerung der Mobilität einiger Lysinseitenketten infolge der Membranbindung nachgewiesen werden. Des Weiteren ließen 13C / 31P Abstandsmessungen einen Abstand der Lysin 13Cε-Kerne zu den 31P-Kernen der Lipidkopfgruppen von 7 - 8 Å vermuten. Die Festkörper-NMR-Untersuchungen legen somit eine Beteiligung einiger Lysine an der Membraninteraktion nahe und eine strukturelle Beeinflussung der Aminosäure T163, die sich an der Oberfläche des Proteins in der Nähe der Helix-α1 befindet. Die Helix-α1, deren Sequenz 5 Lysinreste beinhaltet, wurde in der Literatur als potentielle Membraninteraktionsstelle ausgemacht. Die Ergebnisse dieser Arbeit wiederlegen dieses Bindungsmodell nicht. The viral protein U (VpU) is an accessory membrane protein of HIV-1. Following the infection by HIV-1 VpU plays an important role in evading the immune response of the host and supports the viral spread. The structural investigation of VpU is of great importance to understand the underlying mechanisms in depth. Solid-state NMR and DNP NMR spectroscopy are versatile tools to structurally investigate membrane proteins in nature-like environments. The VpU production needed to be optimized prior to structural studies to yield enough protein. To this account a Codon-optimized VpU construct with a shortened N terminal overhang was cloned and the expression in minimal medium was optimized. Additionally first DNP-NMR experiments of isotopically labeled VpU inserted into liposomes were performed. The DNP-NMR sample preparation was optimized concerning the radical and glycerol content and a first two-dimensional spectrum was recorded, which was in good agreement with solid-state NMR spectra of the protein recorded previously. The 21 kDa protein Nitrophorin 7 (NP7) belongs to a class of heme-binding proteins in the saliva of the blood-sucking insect Rhodnius prolixus. It reversibly binds nitroxid (NO), which is released during the blood meal following a pH change from the insect saliva (pH 5 - 6) to the blood (pH 7,4). NO acts as a vasodilator and blood coagulation inhibitor. The significance of NO in cardiovascular regulation led to the aim to investigate the molecular mechanisms of NO storage and transport in naturally occuring NO-transporting systems, like nitrophorins. In contrast to the other isoforms, NP7 can bind to negatively charged membranes. Additionally NP7 oligomerizes at high concentrations. To this end, solid-state NMR spectroscopy was used to investigate the structural changes in NP7 due to its membrane binding. Reverse isotopically labeled NP7 was produced and bound to liposomes, which were optimized concerning their diameter, head group and the lipid to protein ratio. NMR spectra showed a reverse labeling efficiency of 97 98 % in the different NMR samples. Amino acid specific resonance assignment could be achieved for 40 55 % of the amino acids in the different samples of NP7 and single sequential assignments were obtained. Comparison to an available NP7 crystal structure suggested the visibility of large parts of the protein in NMR spectra. Furthermore it was shown that the overall fold of the protein is not influenced by the membrane interaction. A possible structural change of the amino acid T163 and a decreased mobility of some lysine residues due to membrane binding of NP7 were detected. 13C / 31P-distance measurements supposed a distance of 7 - 8 Å between some lysine Cε-nuclei and the 31P-nuclei of the lipid head groups. The solid-state NMR investigations support an involvement of some lysine residues in the membrane interaction and a structural change of the amino acid T163 located at the surface of the protein near to the helix-α1. The helix-α1, whose sequence contains 5 lysine residues, was discussed in literature as possible membrane binding site of NP7. The findings in this work do not interfere with this binding model.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	04.09.2017
Dateien geändert am:	04.09.2017
Promotionsantrag am:	19.06.2017
Datum der Promotion:	20.07.2017