Dokument: Functional characterization of guanylate binding proteins (GBPs) in the innate and adaptive host defense against pathogens

Titel:	Functional characterization of guanylate binding proteins (GBPs) in the innate and adaptive host defense against pathogens
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43123
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170814-125642-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lindenberg, Valesca [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,64 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.09.2017 / geändert 05.09.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	mGBPs GBPs Toxoplasma Chlamydia Tuberculosis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Interferon gamma (IFNγ) ist ein wichtiges Zytokin, das die Wirtsreaktion gegen intrazelluläre Pathogene reguliert. Durch Stimulation von Zellen mit IFNγ wird eine grpße Zahl von Genen induziert, unter denen die Guanylat-bindenden Proteine (GBPs) hoch exprimiert werden. GBPs sind eine Familie von großen GTPasen, die sich in spezialisierten Kompartimente innerhalb von Zellen lokalisieren können. Bisher wurde gezeigt, dass GBPs zur Kontrolle der Toxoplasma (T.) gondii-Infektion bei Mäusen beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass einige murine (m) GBPs um die parasitophore Vakuole (PV) von Toxoplasma lokalisieren und diese schließlich zerstören können. Die Lokalisierung von mGBP2 an der PV ist abhängig von einem C-terminalen CaaX-Box-Motiv, welches eine Verankerung in die Membran ermöglicht. Dieses Motiv ist jedoch nur in murinen und humanen GBP1, GBP2 und GBP5 vorhanden. Dies wirft die Frage auf, wie andere mGBPs ohne dieses Motiv zur PV rekrutieren. In dieser Studie wurden weitere, bislang unerforschte Motive für die Rekrutierung zur T. gondii PV untersucht. Es wurde festgestellt, dass eine einzige Asparaginsäure im C-terminalen Teil von mGBP6, D542, für die Lokalisation von mGBP6 an der PV wichtig ist. Diese Aminosäure könnte Teil eines vorhergesagten Fes/CIP4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs167 (F-BAR)-Motivs sein, das potentiell in mGBP6, mGBP7, und mGBP10 zu finden ist. Allerdings ist die Abhängigkeit der Lokalisation des Proteins von der Punktmutation von D542 zu einem neutral geladenen Asparagin (N) einzigartig für mGBP6. Eine Verminderung der Lokalisierung zum Parasiten konnte nicht beobachtet werden nachdem andere mGBPs in vergleichbarer Weise an den korrespondierenden Positionen mutiert wurden. Bisher wurde gezeigt, dass Mäuse, die für mGBP1 und mGBP2 defizient sind, anfällig für Infektionen mit intrazellulären Pathogenen sind, insbesondere für T. gondii. Um ein weiteres Mitglied der mGBP Familie zu untersuchen, wurde eine mGBP5-defiziente Mauslinie analysiert. Diese Mauslinie wies jedoch keine veränderte Suzeptibilität gegenüber Toxoplasma-Infektion auf. Daher wurde in dieser Studie die mGBP5-defiziente Mauslinie weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Populationen von Immunzellen zwischen mGBP5-/- und Wildtyp-Mäusen in ihren Frequenzen unverändert sind. Die Phagozytose-Kapazität von aus dem Knochenmark differenzierten Makrophagen war ebenfalls unverändert. Weiterhin konnten Makrophagen beider Genotypen nach IFNγ Stimulation gleichermaßen Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis H37Rv abtöten. Um die Funktion von mGBPs weiter zu charakterisieren, wurde ein zusätzliches in vitro Infektionsmodell etabliert. Chlamydia trachomatis ist ein sexuell übertragbares intrazelluläres Bakterium, gegen das die zellautonome Immunität eine Rolle spielt. Bisher sind die Mechanismen, die zur Abwehr von Chlamydien beitragen, großteils unklar. In dieser Studie wurden Fibroblasten-Zelllinien, die mGBPs N-terminal mit mCherry oder mit GFP fusioniert exprimieren, einer Chlamydien-Infektion unterworfen. Diese Experimente zeigen, dass die Mehrheit der mGBPs mit intrazellularen Chlamydien-Einschlüssen kolokalisieren kann. Die Kolokalisierung an der Chlamydien-Einschlussmembran zeigte sich für mGBP1, mGBP2, mGBP3, mGBP6, mGBP7, mGBP9 und mGBP10, während für mGBP5 und mGBP8 kaum eine Kolokalisation beobachtet wurde. Die Quantifizierung ergab, dass mGBP9 mit ähnlicher Häufigkeit (13%) wie mGBP1 (13%) und mGBP2 (17%) an Chlamydien-Einschlüsse akkumuliert. Durch Vergleich von Quantifizierungen der mGBP-Kolokalisation zwischen Chlamydien- und Toxoplasma-Infektionen wurde ein spezifisches Muster bei der Rekrutierung von mGBPs aufgezeigt. Während zu Chlamydien-Einschlüssen mGBP1, mGBP2 und mGBP9 häufig akkumuliert, wird zur Toxoplasma PV mGBP1, mGBP2 und mGBP6 rekrutiert. Diese Muster implizieren, dass mGBP6 eine wichtige Rolle bei Infektionen mit T. gondii spielt, während mGBP9 eher einen wichtigen Faktor bei der zellautonomen Immunität gegen Chlamydia darstellt. Darüber hinaus zeigen Lebendzellmikroskopie von mGBP2 und mGBP9 in Chlamydien-infizierten Zellen, dass die Akkumulation an der Einschlussmembran authentisch, schnell und transient ist. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal die Dynamik der mGBP-Rekrutierung bei der Chlamydialeninfektion. Zusammenfassend belegt diese Arbeit, dass die Mehrheit der mGBPs sowohl bei Toxoplasma- als auch bei Chlamydien-Infektionen eine Rolle spielen, es jedoch Pathogen-spezifische Muster gibt. Diese Studie lenkt insbesondere die Aufmerksamkeit auf die immunologische Rolle von mGBPs, die auf dem murinen Chromosom 5 codiert sind, z.B. mGBP6 und mGBP9, die bislang in Hinblick auf deren Rolle bei der Abwehr von Pathogenen noch nicht untersucht wurden. Interferon gamma (IFNγ) is a potent cytokine which orchestrates host immunity against intracellular pathogens. Upon stimulation with IFNγ a wide range of genes is induced, amongst which the guanylate binding proteins (GBPs) are abundant. GBPs are a family of large GTPases which can localize at specialized compartments within the mammalian cell. Previously, it was shown that GBPs contribute to the control of Toxoplasma (T.) gondii infection in mice. Some murine (m) GBPs were described to localize and to subsequently disrupt toxoplasma‟s parasitophorous vacuole (PV). Localization of mGBP2 towards the PV was shown to be dependent on a C-terminal CaaX-box motif that allows membrane anchoring. However, this motif is shared only by murine and human GBP1, GBP2 and GBP5. This raises the question how other mGBPs lacking this motif recruit to the PV. In this study, additional novel motifs required for the recruitment to the T. gondii PV were investigated. It was found that a single aspartic acid in the C-terminal part of mGBP6, D542, is important for mGBP6 localization towards the PV. This residue could be part of the predicted Fes/CIP4 homology Bin-Amphiphysin-Rvs167 (F-BAR) motif, which is shared by mGBP6, mGBP7, and mGBP10. However, the dependency on single nucleotide mutation of D542 to a neutrally charged asparagine (N) for recruitment to the PV is unique to mGBP6. The localization towards the parasite was not diminished after corresponding mutations of other mGBPs. Previously, mice deficient for mGBP1 and mGBP2 were shown to be susceptible to infection with intracellular pathogens, specifically T. gondii. To examine further members of the mGBP family, an mGBP5 deficient mouse line was investigated. However, mGBP5 deficient mice were not susceptible to toxoplasma infection. Therefore, in this study, the mGBP5-deficient mouse was investigated in more depth. Here, it is described that immune cell populations do not vary between mGBP5-/- and wild type mice. Also, the phagocytosis capacity of bone marrow derived macrophages was unchanged. Additionally, macrophages of both genotypes invariably killed Mycobacterium bovis BCG or Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacteria after IFNγ stimulation. To further characterize the function of mGBPs, an additional in vitro infection model was established. Chlamydia trachomatis is a sexually transmittable intracellular bacterium against which cell autonomous immunity plays a role. Nevertheless, the different mechanisms contributing to anti-chlamydial defence remain vastly elusive. In this study, a panel of fibroblast cell lines constitutively expressing mGBPs N-terminally fused to mCherry or GFP were established and subjected to chlamydial infection. These experiments reveal that the majority of mGBPs can colocalize with intracellular chlamydia inclusions. Colocalization at the chlamydial inclusion membrane was shown for mGBP1, mGBP2, mGBP3, mGBP6, mGBP7, mGBP9, and mGBP10, whereas mGBP5 and mGBP8 were virtually absent. Quantification revealed that mGBP9 accumulates as often onto chlamydial inclusions (13%), as the most frequently colocalizing mGBP1 (13%) and mGBP2 (17%). By comparing quantifications of mGBP colocalization between chlamydia and toxoplasma infections, a specific pattern in recruitment of mGBPs appears. Whereas chlamydia inclusions most often attract mGBP1, mGBP2 and mGBP9, the toxoplasma PVs are recruited at a high rate by mGBP1, mGBP2 and mGBP6. This pattern suggests that mGBP6 plays a major role in toxoplasma infection, whereas mGBP9 is an important factor in cell autonomous immunity against chlamydial infection. Furthermore, live cell imaging and time lapse microscopy of mGBP2 and mGBP9 in chlamydia infected cells revealed that the accumulation at the inclusion membrane is authentic, fast and transient. These results, for the first time, show the dynamics of mGBP recruitment in chlamydial infection. In summary, this work demonstrated that the majority of mGBPs have functions both in toxoplasma and chlamydial infections, however pathogen specific patterns of recruitment to the pathogen containing compartment exist. This study draws attention to the immunological role of mGBPs encoded on murine chromosome 5, e.g. mGBP6 and mGBP9, which have up till now not been assigned a role in pathogen defence.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	14.08.2017
Dateien geändert am:	05.09.2017
Promotionsantrag am:	07.04.2014
Datum der Promotion:	04.08.2017