Dokument: Charakterisierung und Proteinengineering von P450-Monooxygenasen der CYP154-Familie für die Biokatalyse
| Titel: | Charakterisierung und Proteinengineering von P450-Monooxygenasen der CYP154-Familie für die Biokatalyse | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43091 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170905-101507-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Rühlmann, Ansgar [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Groth, Georg [Betreuer/Doktorvater] | |||||||
| Stichwörter: | P450, Biokatalyse, Resveratrol, CYP | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Die charakterisierten Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYP oder P450) der Familie 154 zeichnen sich durch ihr breites Substratspektrum und ihre hohe Aktivität aus. Daher stellen die noch nicht charakterisierten P450 dieser Familie einen wichtigen Genpool für Enzyme mit biokatalytischem und biotechnologischem Potential dar, weshalb deren Charakterisierung von großem Interesse ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde CYP154F1 aus Thermobifida fusca YX kloniert, exprimiert in E. coli und charakterisiert. Hierzu wurde das Substratspektrum von CYP154F1 untersucht und mit dem verwandten CYP154E1 (Aminosäuresequenz-Identität von 50 %) aus dem gleichen Bakterium verglichen. Es wurde eine Bibliothek von über 100 organischen Verbindungen in in-vitro-Reaktionen mit CYP154F1 getestet. Im Gegensatz zu CYP154E1 erwies sich CYP154F1 als deutlich weniger aktiv und promiskuitiv bezüglich der getesteten Verbindungen. CYP154F1 akzeptierte als Substrate hauptsächlich kleine azyklische organische Verbindungen mit einer Kettenlänge von C8-C10, während CYP154E1 auch größere Substrate wie die Stilbene oder das Sesquiterpenoid (+) Nootkaton akzeptierte. Um auf molekularer Ebene Determinanten zu lokalisieren, die für die unterschiedlichen Substratspektren verantwortlich sind, wurden Homologiemodelle von CYP154F1 und CYP154E1 erstellt. Für die Identifikation der Positionen, welche für die verschiedenen Eigenschaften verantwortlich sind, wurde durch Mutagenese die Substratbindetasche von CYP154F1 sukzessiv an die von CYP154E1 angeglichen. Anschließend wurden die erstellten CYP154-Varianten an einer Auswahl von potentiellen Substraten getestet. Mit dieser Methode konnte die polare Aminosäure Threonin an der Position 234 (Thr234) identifiziert werden, die maßgeblich für das enge Substratspektrum und die niedrige Aktivität von CYP154F1 verantwortlich ist. Durch einen Austausch von Thr234 mit einer hydrophoben Aminosäure konnte das Substratspektrum erweitert und die Aktivität gesteigert werden. In parallel durchgeführten Experimenten konnte mittels Röntgenkristallographie die 3D-Struktur von CYP154F1 erfolgreich aufgeklärt werden. Die Untersuchungen der dreidimensionalen Struktur ermöglichte tiefere Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung von CYP154F1 und trugen zur Erklärung der erhaltenen Ergebnisse bei. So konnte gezeigt werden, dass die Orientierung der Hydroxygruppe des Thr234 der Bindetasche deutlichen polaren Charakter verleiht. Durch den Austausch des Thr234 durch die kleineren hydrophoben Aminosäuren Alanin und Valin wurde nicht nur die Polarität in der Bindetasche geändert, sondern auch ihre Größe. Die entsprechenden Mutanten konnten die Oxidation der größeren, von CYP154E1 akzeptierten Substrate, wie (E)-Stilben und (+) Nootkaton, katalysieren. Hingegen führte der Austausch mit den größeren hydrophoben Aminosäuren Leucin und Methionin zu einer 18- bzw. 25-fachen Steigerung des Umsatzes des kleineren Substrats Geraniol. In einer weiteren Studie konnten die Vorteile von CYP154E1 gegenüber CYP154F1 in der Umsetzung des biotechnologisch interessanten Substrats (E)-Stilben gezeigt werden. CYP154E1 hydroxylierte (E)-Stilben mit 100 %iger Regioselektivität zu (E)-4,4-Dihydroxystilben. Weitere Untersuchungen zeigten, dass CYP154E1 in der Lage ist, nicht nur die aromatische Hydroxylierung von (E)-Stilben, sondern auch von weiteren Stilbenderivaten zu katalysieren, welches eine chemisch anspruchsvolle Reaktion darstellt. Die Produkte dieser Reaktionen gehören zu den Naturstoffen der Stilbenoide, welche für ihre vielfältigen biologischen Aktivitäten bekannt sind. Für die Optimierung der enzymatischen Synthese dieser interessanten Verbindungen wurden zwei unterschiedliche Ansätze gewählt. Zum einen wurde durch semirationales Proteindesign die Aktivität des Biokatalysators gesteigert, zum anderen wurden durch die Zugabe eines Cyclodextrins die Reaktionsbedingungen optimiert. Mit diesen Optimierungen konnten z. B. von (E)-3-Hydroxystilben Konzentrationen von bis zu 20 mM umgesetzt und TTN-Werte (total turnover number) von bis zu 20.000 erreicht werden. Die erzielten Produkttiter von bis zu 4,2 g/l lagen dabei deutlich höher als die der literaturbekannten mikrobiellen Synthesen von Stilbenoiden. Insgesamt konnte so ein biokatalytischer Prozess für die Synthese der fünf Stilbenoide (E)-2,4´-Dihydroxystilben, (E)-3,4´-Dihydroxystilben, Resveratrol, (E) 4,4´ Dihydroxystilben und (E)-2,4´,5-Trihydroxystilben entwickelt werden.The characterized members of the cytochrome P450 monooxygenase (CYP or P450) family 154 are well-known for their broad substrate spectrum and their high activity. Hence, the as yet uncharacterized CYP154 members constitute an important pool for enzymes with biocatalytic and biotechnological potential, and therefore their characterization is of great interest. In this study, CYP154F1 from Thermobifida fusca YX was cloned, expressed in E. coli and characterized. Herein the substrate spectrum of CYP154F1 was investigated and compared to that of the related CYP154E1 (amino acid identity of 50%) from the same bacterium. For this purpose, a library of more than 100 organic compounds was screened as possible substrates for CYP154F1. In contrast to CYP154E1, CYP154F1 proved to be much less promiscuous and less active. CYP154F1 accepted mainly small acyclic organic compounds with a chain length of C8-C10, whereas CYP154E1 also accepted large substrates, such as stilbenes or sesquiterpenoids like (+) nootkatone. To locate molecular determinants that are responsible for the differences in their substrate spectra homology models of CYP154E1 and CYP154F1 were built. A comparison of these models revealed differences in the amino acid composition of the substrate binding pocket. In order to identify which positions are responsible for the different properties, the substrate binding pocket of CYP154F1 was gradually modified by mutagenesis to mimic that of CYP154E1. The obtained CYP154F1 variants were tested for activity using a selection of potential substrates. This procedure enabled the identification of the polar amino acid threonine at position 234 (Thr234) that largely contributes to the narrow range of substrates as well as the low monooxygenase activity of CYP154F1. Substitution of Thr234 with a hydrophobic amino acid led to a broader substrate spectrum and a higher activity. In parallel experiments, the 3D structure of CYP154F1 was successfully determined by x-ray crystallography. In addition, the crystal structure and the mutagenesis studies provided more insight into the structure-function relationship of CYP154F1. It could be shown that the orientation of the hydroxy group of Thr234 is responsible for the remarkable polar character of the substrate binding pocket. Substitution of Thr234 with the small, hydrophobic amino acids alanine or valine increased the hydrophobicity and size of the binding pocket. Thus, the corresponding mutants were able to convert larger substrates like (E)-stilbene and (+) nootkatone, which are also substrates of CYP154E1. Substitution with the larger hydrophobic leucine or methionine led to an 18- or 25-fold increase, respectively, in the conversion of the smaller substrate geraniol. In a comparative study, CYP154E1 proved superior to CYP154F1 in converting the biotechnologically interesting substrate (E)-stilbene. CYP154E1 was able to hydroxylate (E)-stilbene to (E)-4,4-dihydroxystilbene with 100% regioselectivity. Moreover, CYP154E1 catalyzed not only aromatic hydroxylation of (E)-stilbene, but also of stilbene derivatives, which is a challenging task in chemical synthesis. The products of these reactions belong to the class of stilbenoids, which are known for their various biological activities. To improve the activity of CYP154E1, two different approaches were followed. On the one hand, the activity of the biocatalyst was increased by protein engineering. On the other hand, the reaction conditions were improved by the addition of a cyclodextrin. With these improvements, up to 20 mM of (E)-3-hydroxystilbene were converted and total turnover numbers of up to 20,000 were obtained. Product titers of more than 4.2 g/l were achieved, which are higher than that of previously described microbial synthesis of stilbenoids. In total, a biocatalytic process for the synthesis of the five stilbenoids (E)-2,4´-dihydroxystilbene, (E)-3,4´-dihydroxystilbene, resveratrol, (E) 4,4´ dihydroxystilbene und (E)-2,4´,5-trihydroxystilbene were developed. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 05.09.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 05.09.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 24.04.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 06.07.2017 |
