Dokument: Investigations of the structural organization of the Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) protein, a major risk factor for mental illness

Titel:	Investigations of the structural organization of the Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) protein, a major risk factor for mental illness
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43067
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170808-153454-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Yerabham, Antony Sravan Kumar [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,87 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.08.2017 / geändert 08.08.2017
Beitragende:	Prof. Dr. med. Korth, Carsten [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Major mental illnesses such as schizophrenia, major depression, bipolar disorder are devastating conditions affecting adaptive behavior and personality of an individual. Both genetic pre-disposition and environmental factors have been shown to be causal for mental illnesses. Nevertheless, the exact molecular etiology of these complex neuropsychiatric conditions remains unclear. Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1) is an important mental illness genetic risk factor. It was discovered at a genetic loci disrupted by a balanced chromosomal translocation (1; 11) (q42.1; q14.3) and showing strong linkage with mental illnesses in a large Scottish family. The gene was also reported to have a frame-shift mutation, thereby shortened, in an American family with mental illness. The DISC1 protein interacts with a large number of binding partners; many of them being themselves crucial players in various neuronal signalling pathways or brain diseases. Given the high neurological relevance, understanding of DISC1’s functional mechanism is still only vague and one of the reasons for this is the lack of sufficient structural information. In this cumulative thesis, comprising three publications, I attempt to provide new insights of the DISC1 protein’s structure and thereby its potential molecular actions by a functional-module based approach. In the first manuscript, the hypothesis is put forward that DISC1 could be a scaffold protein due to its large protein-interaction network, therefore its features are compared to that of other well-known scaffolding proteins (such as the Ste5 and the AKAP proteins). From the available data, it was here found that DISC1 has many, but not all, the features of a scaffold protein. It is also observed that DISC1 is a ‘Diverse Inhibitor of Signalling Cascades’ as it regulates a wide range of enzymes of interrelated signalling cascades, mostly through inhibition. Finally, DISC1 acts in a similar manner to other scaffold proteins by orchestrating different signalling pathways in a modular fashion. Thus, it also potentially has multiples of these modules or localisation regions in various arrangements for efficient functioning. In the second manuscript, studies on the DISC1 protein sub-domain structure were performed. This has previously proven difficult due to the high insolubility and aggregation propensity of the full length recombinant protein when expressed in bacteria. Here we employed a high-throughput Expression of Soluble Protein by Random Incremental Truncation (ESPRIT) technique to identify the structured regions within the human DISC1 protein, by assessing the solubility of tens of thousands of randomly truncated fragments of recombinant DISC1. Based on the assumption that structured regions in a protein are responsible for its functions, we identified and characterized four structured regions within the DISC1 protein, which we proposed to form the basic domain structure. These were named as D, I, S and C and are found at amino acids 257-383, 539-655, 635-738 and 691-836 respectively. The newly proposed domain structure gives a coherent explanation for the effects caused in the truncation caused by the Scottish chromosomal translocation. Based on this domain information, a mimic of the frame-shift mutant of DISC1 C region was characterized and found to form aberrantly multimeric and aggregated complexes with an unstable secondary structure. Thus, the newly proposed soluble regions of DISC1 protein provides a powerful platform for further investigations of the structure and function of the protein. The third manuscript concerns the generation and characterization of a camelid single-chain antibody against the C-terminus of the DISC1 protein. This was further used in combination with the 6 recombinant DISC1 C region (described in manuscript 2), to obtain a structural envelope by small-angle X-ray (SAXS) analysis and partially validate the ab-initio modeling of the C region. From our model, several insights into structure of the DISC1 C region could be hypothesized relating to its functioning. This camelid antibody has a high potential to serve as a useful tool for a wide range of applications and further investigations of the DISC1 protein. In conclusion, this thesis provides a functional-module based approach to investigate the structure of the DISC1 protein. The results obtained here gave novel insights into the structural organisation of the protein and hint towards its probable mode of functioning. The domain architecture obtained and the camelid antibody generated can facilitate further module based investigations and ultimately pave the way towards obtaining an experimental structure of DISC1 and understanding of its functional mechanism. Mentale Erkrankungen wie Schizophrenie, Depressionen und bipolare Störungen sind Krankheitsbilder mit verheerenden Auswirkungen auf das Verhalten und die Persönlichkeit eines Menschen. Obwohl die genaue Ätiologie dieser komplexen neuropsychiatrischen Erkrankungen bis heute unklar ist, sind bekanntermaßen sowohl eine genetische Prädisposition als auch Umweltfaktoren bei deren Entstehung von Bedeutung. DISC1 ist einer der am besten untersuchten genetischen Risikofaktoren mentaler Erkrankungen. Es wurde erstmals an einem von einer balancierten chromosomalen (1; 11) (q42.1; q14.3) Translokation betroffenen genetischen Locus in einer schottischen Familie entdeckt und zeigt eine starke Assoziation mit verschiedenen mentalen Erkrankungen. Weiterhin wurde eine Nonsense-Mutation in einer amerikanischen Familie beschrieben, welche zu einem C-terminal verkürzten Protein führt. Bislang gibt es keine Evidenz für eine enzymatische Aktivität des DISC1-Proteins, allerdings interagiert es mit einer Vielzahl für neurologische Prozesse wichtiger Proteine. Trotz dieser neurologischen Relevanz ist die Funktion von DISC1 noch immer ungeklärt, und einer der wichtigsten Gründe dafür ist der Mangel an ausreichenden strukturellen Informationen. In dieser kumulativen Doktorarbeit, die auf drei wissenschaftlichen Publikationen beruht, möchte ich neue Einsichten bezüglich der Proteinstruktur von funktionalen Domänen des DISC1-Proteins (und damit deren Bedeutung für Funktion und Dysfunktion) darlegen. Im ersten Manuskript werden die Eigenschaften des Gerüstproteins DISC1, das über ein weitreichendes Interaktionsnetzwerk verfügt, mit denen anderer bekannter Gerüstproteine, wie Ste5 und AKAP, verglichen. Anhand der verfügbaren publizierten Daten konnte im Übersichtsartikel gezeigt werden, dass DISC1 viele, aber nicht alle, Eigenschaften eines Gerüstproteins aufweist. Es wurde gezeigt, dass DISC1 als ein ‘Diverse Inhibitor of Signalling Cascades’, also ein ’vielseitiger Inhibitor von Signalkaskaden’ fungiert, welcher eine Vielzahl von Enzymen diverser zusammenhängender Signalkaskaden reguliert, meist durch deren Inhibition. DISC1 agiert vergleichbar mit anderen Gerüstproteinen, indem es verschiedene Signalkaskaden auf eine modulare Weise beeinflusst. Demnach hat DISC1 auch diverse Domänen, die in verschiedenen Gruppierungen für effiziente Funktionalität sorgen. Im zweiten Manuskript habe ich nach technischen Lösungen gesucht, die eine effiziente Aufreinigung und Charakterisierung des in hohem Maße unlöslichen und aggregierenden DISC1 in Bakterien ermöglichen. Es wurde die Hochdurchsatzmethode ’Expression of Soluble Protein by Random Incremental Truncation (ESPRIT)’ Technik angewandt mit dem Ziel, strukturierte Regionen innerhalb des humanen DISC1 Proteins zu identifizieren. Dafür wurde zunächst die Löslichkeit von Zehntausenden zufällig trunkierten DISC1-Proteinfragmenten analysiert. Basierend auf der generellen Annahme, dass strukturierte Regionen innerhalb eines Proteins für dessen Funktion verantwortlich sind, wurden vier strukturierte Domänen innerhalb von DISC1 identifiziert und 8 charakterisiert. Aus den Daten geht hervor, dass diese eine grundlegende Domänenformation bilden. Die vier strukturierten Regionen wurden D, I, S und C genannt und umfassen die Aminosäuren 257-383, 539-655, 635-738 und 691-836. Diese vorgeschlagene Domänenstruktur liefert eine logische Erklärung für die durch die chromosomale Translokation in der schottischen Familie versursachten Effekte. Basierend auf den Domäneninformationen wurde auch eine Nachbildung der Leserahmen-Mutation innerhalb der DISC1-C-Region charakterisiert, welche abberante multimere und aggregierte Komplexe mit einer instabilen Sekundärstruktur bilden. Die von uns vorgeschlagenen löslichen Domänen von DISC1 liefern demnach eine wichtige Plattform für weitergehende Untersuchungen der Struktur und Funktion des Proteins. Das dritte Manuskript beschäftigt sich mit der Generierung und Charakterisierung eines rekombinanten kameliden Antikörperfragmentes, das gegen den C-Terminus von DISC1 gerichtet ist. Dieser Antikörper wurde in Kombination mit der DISC1-C-Region benutzt (Beschreibung der C-region befindet sich im zweiten Manuskript), um strukturelle Hinweise via der ’small-angle X-ray scattering’ (SAXS)-Analyse zu erhalten und dadurch teilweise das ab-initio Modell der C-Region zu validieren. Ausgehend von unserem Modell kann nun über verschiedene potentielle Einsichten bezüglich der Struktur und Funktion des DISC1-Proteins spekuliert werden. Der kamelide Antikörper birgt ein hohes Potential, um als nützliches Werkzeug für eine Vielzahl an Applikationen und weiterführender Untersuchungen des DISC1-Proteins zu dienen. Zusammenfassend liefert die hier vorgestellte kumulative Doktorarbeit einen Ansatz zur Untersuchung des DISC1-Proteins, der auf dessen funktionalen Domänen basiert. Die hier vorgestellten Ergebnisse führen zu neuen Einsichten bezüglich der strukturellen Organisation des Proteins und deuten auf mögliche Funktionsweisen des DISC1-Proteins hin. Die erlangte Domänenarchitektur und der generierte kamelide Antikörper können weitergehende Modul-basierte Untersuchungen vereinfachen und auf diese Weise den Weg zu einer experimentellen Struktur des DISC1-Proteins und dem Verständnis seines funktionellen Mechanismus ebnen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	08.08.2017
Dateien geändert am:	08.08.2017
Promotionsantrag am:	01.10.2012
Datum der Promotion:	31.07.2017