Dokument: Conformational dynamics of the ligand-free state of a riboswitch investigated by molecular simulations

Titel:	Conformational dynamics of the ligand-free state of a riboswitch investigated by molecular simulations
Weiterer Titel:	Konformationelle Dynamik des ungebundenen Zustandes eines Riboswitches untersucht mittels molekularen Simulationen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=43055
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170808-091157-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hanke, Christian Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 35,90 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.08.2017 / geändert 07.08.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] Prof. Dr. Lercher, Martin [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Riboswitches are a class of regulatory RNA molecules mainly found in bacterial mRNA. They typically consist of an aptamer domain and an expression platform and regulate gene expression based on the availability of a ligand. Upon binding of the ligand to the aptamer domain, the expression platform undergoes a conformational change, which results in altered gene expression. Understanding of the unbound state of riboswitches is crucial as a first step towards understanding the riboswitch-based gene regulation process. However, detailed structural knowledge of the unbound state is still scarce despite experimental and omputational efforts, likely due to the marginally stable character of the riboswitch that is required for fast switching after ligand binding. In this thesis, I investigated the unbound state of a guanine-sensing riboswitch aptamer domain using molecular simulations. I particularly focused on the stability of tertiary interactions formed between two loops and their influence on the aptamer domain. To this end, I used a wildtype guanine-sensing riboswitch aptamer and a mutant, which features destabilized tertiary interactions and exhibits a Mg2+-dependent ligand binding behavior. Initially, I had to decide for a setup for the molecular dynamics (MD) simulations with respect to the force field and the initial configuration of the simulation system. The chosen setup was required to reproduce the experimentally observed differences between wildtype and mutant. Based on this setup, I performed MD simulations of the two aptamer variants at different Mg2+ concentrations. From these simulations, I observed that the mutation has a long-range destabilizing effect from the loop region to the ~30 Å distant ligand binding site. This destabilizing effect is compensated by the presence of Mg2+ ions. Furthermore, I found that stable tertiary interactions together with the stabilization of the ligand binding site can cooperatively stabilize the terminal P1 region. The results from this study suggest that the information on the stability of the tertiary interactions and on the ligand binding are not transferred via large conformational changes, but rather via changes in dynamics. This would allow for a fast response of a preorganized aptamer upon ligand binding. In order to gain insights into the conformational heterogeneity of the unbound state, I performed replica exchange MD simulations and calculated free energy landscapes for the aptamers. From these results I found that for the wildtype, a homogeneous conformational ensemble close to the native bound state is energetically favorable, which exhibits local flexibility to allow for ligand binding. In contrast, for the mutant I observed a more heterogeneous structural ensemble in the unbound state, which includes alternative base pairs and folds. Overall, the results suggest that the destabilized tertiary interactions in the mutant shift the folding kinetics from a directed folding without notable traps for the wildtype towards a slower folding, which includes alternative conformations. In my thesis, I gained insights into the unbound state, long-range effects in the aptamer and the role of the tertiary interactions in the stability and conformational heterogeneity of the guanine-sensing riboswitch aptamer. Such insights could be useful for the development of novel antibiotic drugs targeting riboswitches, where information about the ligand binding site is crucial, or for the design of synthetic riboswitches, where a particular behavior of the aptamer is desired. Riboswitches sind eine Gruppe von regulatorischen RNA-Molekülen, die überwiegend in bakterieller mRNA vorkommt. Sie bestehen üblicherweise aus einer Aptamerdomäne und einer Expressionsplattform und regulieren die Expression von Genen abhängig von der Verfügbarkeit eines Liganden. Das Binden des Liganden an die Aptamerdomäne induziert eine Konformationsänderung in der Expressionsplattform, wodurch die Genexpression beeinflusst wird. Das Verständnis des ungebundenen Zustandes eines Riboswitches ist ein wichtiger erster Schritt hin zum Verständnis der Riboswitch-basierten Genregulation. Trotz experimentellen und computergestützten Anstrengungen ist das detaillierte strukturelle Verständnis des ungebundenen Zustandes noch begrenzt. Ein möglicher Grund hierfür ist der marginal stabile Charakter des Riboswitches, der für eine schnelle Reaktion nach der Ligandbindung notwendig ist. In dieser Arbeit habe ich den ungebundenen Zustand einer Guanin-bindenden Riboswitch-Aptamerdomäne mittels molekularer Simulationen untersucht. Hierbei konzentrierte ich mich insbesondere auf die Stabilität von tertiären Wechselwirkungen, die zwischen zwei Loop-Regionen gebildet werden, und deren Einfluss auf die Aptamerdomäne. Hierfür verwendete ich eine Wildtyp-Aptamerdomäne eines Guanin-bindenden Riboswitches und eine Mutante, welche destabilisierte tertiäre Wechselwirkungen aufweist und hierdurch ein Mg2+-abhängiges Ligandbindungsverhalten zeigt. Zunächst musste ich ein geeignetes Setup bezüglich des Kraftfeldes und der Startkonfiguration für die Moleküldynamik (MD)-Simulationen wählen. Das gewählte Setup musste in der Lage sein, experimentell beobachtete Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der Mutante reproduzieren zu können. Aufbauend auf diesem Setup führte ich MD-Simulationen der beiden Aptamervarianten bei unterschiedlichen Mg2+ Konzentrationen durch. In diesen Simulationen beobachtete ich, ausgehend von der destabilisierten Loop-Region, eine Destabilisierung der ~30 Å entfernten Ligandbindestelle. Dieser destabilisierende Effekt konnte durch die Anwesenheit von Mg2+-Ionen in der Simulation ausgeglichen werden. Darüber hinaus fand ich heraus, dass stabile tertiäre Wechselwirkungen in der Loop-Region zusammen mit einer stabilisierten Ligandbindestelle einen kooperativen, stabilisierenden Einfluss auf die P1-Region haben, an welche die Expressionsplattform anschließt. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass Informationen über die Stabilität der tertiären Wechselwirkungen und über die Ligandbindung nicht durch große strukturelle Änderungen, sondern vielmehr durch Änderungen in der Dynamik übertragen werden. Solch eine Übertragung würde eine schnelle Reaktion auf die Bindung eines Liganden erlauben. Um einen Einblick in die konformationelle Heterogenität des ungebundenen Zustandes zu erhalten, führte ich replica exchange MD-Simulationen durch und berechnete freie Energie-Landschaften. Die Ergebnisse dieser Berechnungen zeigen, dass der ungebundene Zustand des Wildtyps aus einem homogenen Strukturensemble besteht, welches dem gebundenen Zustand ähnlich ist. Gleichzeitig besitzen die Strukturen jedoch lokale Flexibilität um die Bindung eines Liganden zu erlauben. Im Gegensatz hierzu beobachtete ich für den ungebundenen Zustand der Mutante ein heterogeneres Strukturensemble, welches alternative Basenpaarungen und Faltungen einschließt. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die destabilisierten tertiären Wechselwirkungen in der Mutante die Faltungskinetik von einem gerichteten Faltungsprozess ohne nennenswerte Intermediate hin zu einem langsameren Faltungsprozess verschiebt, welcher alternative Konformationen beinhaltet. Durch die Ergebnisse meiner Arbeit erhielt ich tiefgehende Einblicke in den ungebundenen Zustand, langreichweitige Effekte und den Einfluss der tertiären Wechselwirkungen auf die Stabilität und die konformationelle Heterogenität der Guanin-bindenden Riboswitch Aptamerdomäne. Solche Einblicke können sich für die Entwicklung neuer Antibiotika, die auf Riboswitches abzielen, als hilfreich erweisen. Darüber hinaus können diese Einblicke für die Entwicklung von synthetischen Riboswitches nützlich sein, bei denen ein bestimmtes Verhalten der Aptamerdomäne gewünscht ist.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	08.08.2017
Dateien geändert am:	08.08.2017
Promotionsantrag am:	31.08.2016
Datum der Promotion:	30.09.2016