Dokument: Regulation der Mitophagie in Saccharomyces cerevisiae durch Ubiquitinierung und Deubiquitinierung
| Titel: | Regulation der Mitophagie in Saccharomyces cerevisiae durch Ubiquitinierung und Deubiquitinierung | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42939 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170725-105832-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Behrendt, Christina [Autor] | |||||||
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| Stichwörter: | Ubiquitinierung, Deubiquitinierung, Mitophagie | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Mitochondrien sind doppelmembranöse, essentielle Organelle, dessen Aufgabe unter anderem die zelluläre Energiebereitstellung in Form von ATP ist. Als Nebenprodukt der ATP-Synthese entstehen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die neben der Funktion als Signalstoffe auch zu erheblichen Schäden in der Zelle, u.a. Schädigung der mtDNA, Lipide und Proteine, führen können. Dysfunktionale Mitochondrien sind mit zahlreichen humanen Erkrankungen assoziiert. Die autosomal dominante Optikusatrophie Typ 1, Krebs, Charcot-Marie-Tooth Neuropathie Typ 2A und 4A, Diabetes und Morbus Parkinson sind nur einige Beispiele (Amati-Bonneau et al, 2008; Patti & Corvera, 2010; Schroder, 2006). Zur Beschränkung bzw. Vermeidung mitochondrialer Schäden hat die Zelle zahlreiche Qualitätskontrollmechanismen entwickelt (Ni et al, 2015). Beispielsweise erkennen molekulare Chaperone falsch gefaltete Proteine und sind Bestandteile der Proteinqualitätskontrolle. Ganze Mitochondrien können über einen selektiven Prozess der Autophagie, genannt Mitophagie, abgebaut werden. Die Autophagie stellt einen zellulären Prozess dar, bei dem cytoplasmatische Komponenten in die Vakuole bzw. Lysosom (bei Säugern) transportiert und durch Hydrolasen abgebaut werden. Hypoxie, Infektionen oder Nährstoffmangel führen zur vermehrten Aktivierung der Autophagie. Generell wird zwischen selektiver und nicht-selektiver Autophagie unterschieden, wobei das erstere sich durch die spezifische Sequestrierung von bestimmen Proteinen oder Organellen auszeichnet. In den letzten Jahren wurden zahlreiche selektive Arten der Autophagie, sowie mehr als 40 Atg-Gene (engl. ,autophagy-related‘), deren Produkte an der selektiven und nicht-selektiven Autophagie beteiligt sind, identifiziert. Einige sind nur für spezifische autophagische Prozesse verantwortlich. Beispielsweise wurde das mitochondriale Außenmembranprotein Atg32 als spezifischer Rezeptor für die Induktion der Mitophagie in Hefe entdeckt (Kanki et al, 2009b; Okamoto et al, 2009). Generell unterscheidet man zwei prinzipielle Reaktionswege zum selektiven Abbau von Mitochondrien: die Ubiquitin-vermittelte und die Rezeptor-vermittelte Mitophagie (Tan et al, 2016). In Säugerzellen sind beide Prinzipien weitgehend untersucht. In S.cerevisiae wurde bislang nur die Rezeptor-vermittelte Mitophagie dokumentiert. Neuste Studien demonstrieren, dass die Ubiquitin-vermittelte Eliminierung von Mitochondrien in Bäckerhefe prinzipiell möglich ist. Durch Expression der humanen E3-Ligase-Parkin in S.cerevisiae konnte eine erhöhte Mitophagie, sowie eine vermehrte Resistenz gegen oxidativem Stress gemessen werden (Pereira et al, 2015). Der molekulare Mechanismus und die Regulation des selektiven Abbaus von Mitochondrien sind trotzdem weitgehend unklar. Das Ziel dieser Arbeit war die Rolle der Ubiquitinierung und Deubiquitinierung in der Regulation der Mitophagie in S.cerevisiae zu bestimmen. In Kooperation mit Matthias Müller wurde der Ubp3/Bre5-Deubiquitinase-Komplex als negativer Modulator der Mitophagie und Aktivator der nicht-selektiven Autophagie identifiziert (Müller et al, 2015). Dieser Befund legt zum ersten Mal dar, dass die Ubiquitinierung an der Regulation des selektiven Abbaus von Mitochondrien beteiligt ist. Die nähere Charakterisierung des Enzymkomplexes im Rahmen dieser Arbeit zeigte, dass die katalytische Aktivität der Ubiquitin-spezifischen Protease Ubp3 essentiell für den Einfluss auf die Mitophagie und die nicht-selektive Autophagie ist. Zusammen mit der Translokation des Ubp3/Bre5-Deubiquitinase-Komplexes vom Zytosol zu den Mitochondrien nach Rapamycin-induzierter Mitophagie, untermauern diese Ergebnisse die regulatorische Funktion des Enzymkomplexes in der selektiven Eliminierung von Mitochondrien. Die Deletion von UBP3 führte zur massiven Reduktion an Deubiquitinierung von mitochondrialen Proteinen nach Rapamycin-Behandlung. Dieses Resultat ist ein starker Beleg dafür, dass Ubp3 die Hauptdeubiquitinase ist, die an der mitochondrialen Außenmembran agiert und dadurch die Mitophagie hemmt. Interessanterweise war der Einfluss des Ubp3/Bre5-Deubiquitinase-Komplexes auf die Mitophagie abhängig von Atg32, da die Doppeldeletion von ATG32 und UBP3 bzw. BRE5 einen Block an mtALP-Aktivität zeigte. Die Ubiquitin-vermittelte Mitophagie scheint demnach mit der Rezeptor-vermittelten Mitophagie verknüpft zu sein, abweichend von der Situation in Säugerzellen. Eine wichtige Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass die Deletion des Polyubiquitin-kodierenden Gens UBI4, als einziges von drei nicht-essentiellen Ubiquitin-kodierenden Genen, zu einer Beeinträchtigung der Rapamycin-induzierten Mitophagie führte. UBI1 und UBI2 zeigten eine zum Teil reziproke Regulation der Ribophagie und einen Einfluss auf die ER-phagie. Diese Ergebnisse beweisen, dass diese zwei Ubiquitin-kodierenden Gene generell in der Lage sind Ubiquitin für eine selektive Form der Autophagie bereit zu stellen. Die Inhibition der Mitophagie durch Deletion von UBI4 wurde auch für andere Induktionsmethoden (Wachstum in der stationären Phase und Stickstoffmangel) beobachtet und zeigt, dass der Einfluss sich nicht auf die Rapamycin-induzierte Mitophagie beschränkt. Zudem konnte die K48-Ubiquitinkettenverknüpfung, aber nicht K63, als notwendig für eine effektive Mitophagie-Aktivität identifiziert werden. Darüber hinaus war die inhibitorische Regulation des selektiven Abbaus von Mitochondrien vermittelt durch die Deubiquitinase Ubp3 abhängig von UBI4. Die Hemmung der Mitophagie durch Deletion von UBI4 wurde durch das zusätzliche Fehlen von ATG32 verstärkt und zeigt ein weiteres Beispiel dafür auf, dass die Ubiquitin-vermittelte und die Rezeptor-vermittelte Mitophagie verknüpft sind. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit nach dem Substrat der Ubiquitin-vermittelten Mitophagie gesucht und das mitochondriale Außenmembranprotein Fzo1 identifiziert. Die Deletion von FZO1 führte zu einer starken Reduktion der Mitophagie, die durch Expression des Proteins komplementiert werden konnte. In Säugerzellen konnte bereits eine ähnliche Rolle für das Fzo1 Ortholog, Mfn1/2, beobachtet werden (Gegg et al, 2010; Poole et al, 2010; Ziviani et al, 2010). Für die selektive Eliminierung von Mitochondrien waren die Ubiquitinierung von Fzo1, sowie das Lysinrest 464 erforderlich. Die Beeinträchtigung der mitochondrialen Außenmembranfusion führte generell nicht zur Hemmung der Mitophagie. Eine vermehrte Ubiquitinierung von Fzo1 konnte im Δubp3 Stamm nicht detektiert werden und ist vermutlich auf einen verstärkten proteasomalen Abbau zurückzuführen.
Zusammenfassung konnte ein Weg des selektiven Abbaus von Mitochondrien aufgezeigt werden, der dynamisch durch die UBI4-vermittelte Ubiquitinierung und UBP3-vermittelte Deubiquitinierung reguliert wird und Fzo1 als Substrat der Ubiquitin-vermittelten Mitophagie beinhaltet. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass S.cerevisiae ein sehr nützlicher Modellorganismus für die Analyse der Regulation der Ubiquitin-vermittelten Mitophagie und möglicher anderer Formen der selektiven Autophagie ist.Mitochondria are double-membraned essential organelles whose function is the cellular production of ATP. As a by-product of ATP synthesis, reactive oxygen species (ROS) are generated which in addition to their function as a signaling molecule can also cause damage to mtDNA, lipids and proteins. Dysfunctional mitochondria are associated with numerous human diseases. The autosomal dominant optic atrophy type 1, cancer, Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A and 4A, diabetes and Parkinson's disease are only a few examples (Amati-Bonneau et al, 2008; Patti & Corvera, 2010; Schroder, 2006). In order to limit or prevent mitochondrial damage the cell has developed several quality control mechanisms (Ni et al, 2015). For example, molecular chaperones recognize misfolded proteins and are components of protein quality control. Whole mitochondria can be degraded via a selective type of autophagy called mitophagy. Autophagy is a cellular process in which cytoplasmic components are transported into the vacuole or lysosome (in mammals) and are degraded by hydrolases. Several selective types of autophagy as well as more than 40 Atg (autophagy-related) genes have been identified. Some are only responsible for specific types of autophagy. For example, the mitochondrial outer membrane protein Atg32 was identified as a receptor for the induction of mitophagy in yeast (Kanki et al, 2009b; Okamoto et al, 2009). In general, mitophagy can be classified into receptor-mediated and ubiquitin-mediated pathways (Tan et al, 2016). Both principles are extensively studied in mammals. In yeast only the receptor-mediated mitophagy has been discovered. Previous studies demonstrated that ubiquitin-mediated elimination of mitochondria is possible in principle. Expression of the human E3 ligase Parkin in S.cerevisiae showed increased mitophagy as well as increased resistance to oxidative stress (Pereira et al, 2015). Nevertheless, the molecular mechanism and the regulation of the selective degradation of mitochondria is mainly unclear. Therefore, the general aim of this study was to determine the role of ubiquitylation and deubiquitylation in the regulation of mitophagy in S. cerevisiae. In cooperation with Matthias Müller the Ubp3/Bre5-deubiquitinase-complex was identified to specifically inhibit mitophagy and simultaneously promote non-selective autophagy (Müller et al, 2015). This finding shows for the first time that ubiquitylation is involved in regulating mitophagy. The characterization of the enzyme complex shows that the catalytic activity of the ubiquitin-specific protease Ubp3 is essential for the influence on mitophagy and non-selective autophagy. Together with the translocation of the Ubp3/Bre5-deubiquitinase-complex from the cytosol to the mitochondria after rapamycin treatment (Müller et al, 2015) they support the regulatory function of the enzyme complex in mitophagy. The deletion of UBP3 led to a massive reduction in deubiquitylation of mitochondrial proteins after rapamycin-induced mitophagy. This result is strong evidence that Ubp3 is the main deubiquitinase which acts upon the mitochondrial outer membrane and therefore inhibits mitophagy. Interestingly, the influence of the Ubp3/Bre5-deubiquitinase-complex on mitophagy was Atg32-dependent since the double deletion of ATG32 and UBP3 or BRE5 showed a block of mtALP activity. Thus, ubiquitin-mediated mitophagy appears to be linked to receptor mediated mitophagy unlike the situation in mammals. Another important finding of this work is that the deletion of the polyubiquitin-encoding gene UBI4 is the only one of three non-essential ubiquitin-encoding genes that leads to an impairment of rapamycin-induced mitophagy. UBI1 and UBI2 showed a partially reciprocal regulation of ribophagy and ER phagy. These results demonstrate that the two ubiquitin-encoding genes (UBI1 and UBI2) are generally able to provide ubiquitin for a selective form of autophagy. The inhibition of mitophagy by deletion of UBI4 was also observed for other mitophagy induction methods (stationary phase and nitrogen starvation) and shows that the effect is not limited to rapamycin-induced mitophagy. In addition, the K48 ubiquitin chain linkage but not K63 was required for mitophagy. The inhibitory regulation of the selective degradation of mitochondria mediated by the deubiquitinase Ubp3 was dependent on UBI4. The inhibition of mitophagy by deletion of UBI4 was enhanced by the additional lack of ATG32 and shows another example of the linkage of ubiquitin-mediated and receptor-mediated mitophagy. Furthermore, we searched for the substrate of ubiquitin-mediated mitophagy and identified the mitochondrial outer membrane protein Fzo1. Deletion of FZO1 led to a strong reduction in mitophagy which was complemented by expression of the protein. A similar role for the Fzo1 ortholog, Mfn1/2, was observed in mammalian cells (Gegg et al, 2010; Poole et al, 2010; Ziviani et al, 2010). For the selective elimination of mitochondria the ubiquitylation of Fzo1 and lysine residue 464 were necessary. The impairment of mitochondrial fusion generally did not lead to the inhibition of mitophagy. An increased ubiquitylation of Fzo1 could not be detected in the Δubp3 strain and is presumably due to increased proteasomal degradation. In summary, a pathway of selective mitochondrial degradation was demonstrated which is dynamically regulated by UBI4-mediated ubiquitylation, UBP3-mediated deubiquitylation and Fzo1 as a substrate of ubiquitin-mediated mitophagy. Overall, S.cerevisiae has been shown to be a very useful model organism for the analysis of the regulation of ubiquitin-mediated mitophagy and possible other forms of selective autophagy. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 25.07.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 25.07.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.04.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.06.2017 |
