Dokument: Structural characterization of recombinant fibrillar human Islet Amyloid Polypeptide by solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
| Titel: | Structural characterization of recombinant fibrillar human Islet Amyloid Polypeptide by solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | |||||||
| Weiterer Titel: | Strukturuntersuchungen an rekombinantem, fibrillärem Insel Amyloid Polypeptid mittels Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42904 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170731-110747-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Weirich, Franziska [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Festkörper-NMR, Proteinfehlfaltung, Diabetes Mellitus Typ 2, solid-state NMR, fibrils, protein aggregation, IAPP, Amylin, Islet Amyloid Polypeptide | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In this thesis, the method of solid-state Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy was applied to solve a specific question from the field of protein misfolding diseases. Representatives of protein misfolding diseases are diabetes mellitus type II, Alzheimer´s disease, and Parkinson´s disease. A hallmark of protein misfolding diseases is the extracellular deposition of misfolded proteins, either localized in affected tissue, or systemic throughout the body. The process of protein misfolding leads in many cases to the formation of insoluble amyloid fibrils. Amyloid fibrils formed by a range of different proteins show a highly ordered and repetitive structure, which is rich in β-sheet content. Elucidation of fibril structures on the molecular level is one of the central research topics in the field of protein misfolding diseases. The topic of this dissertation was the structural characterization of fibrillar human Islet-Amyloid-Polypeptide (IAPP) by solid-state NMR.
IAPP is a 37 amino acid residue peptide that is cosecreted with insulin by pancreatic β-cells. IAPP is soluble and intrinsically disordered in its physiological form, however it shows a high propensity to aggregation and fibril formation. Pancreatic amyloid deposits, which consist mainly of IAPP, correlate with type II diabetes mellitus and are found in 90% of individuals affected by T2DM. Human IAPP has an oxidized disulfide bridge in its N-terminus and an amidated C-terminus. In this thesis, recombinantly expressed IAPP with an intact disulfide bridge, but without an amidated C-terminus, was used. It is denoted as IAPP(COOH). Solid-state NMR is a versatile tool to study the structure of fibrils built from full length proteins. These samples are not amenable to X-ray crystallography or liquid-state NMR, because they are non-crystalline and insoluble. Solid-state NMR studies on biomolecules are based on the NMR active isotopes 1H, 13C, and 15N, employing isotope labelling strategies. Information on secondary and tertiary structure is contained in chemical shifts and strengths of dipolar couplings. A full site-specific resonance assignment was achieved from the ssNMR study on fibrillar IAPP. An analysis of secondary structure was performed based on the chemical shifts. One major conformation was observed, consisting of three β-strands. The amyloidogenic segment 22NFGAILS28 was also found to be part of a β-strand. Furthermore, the N-terminus showed well resolved and intense peaks at 0°C, that broadened below detectability upon freezing to -170°C. These results have been published in the journal PLoS One in 2016. Following experiments aimed at the detection of through-space dipolar couplings, which contain information on the tertiary structure of the molecules within the fibril. Two more samples were prepared, applying a labelling approach that yields a diluted distribution of 13C spins in the samples. The dilution of NMR-active spins enables the detection of weak through-space dipolar couplings, which are attenuated in uniformly labelled samples by the effect of dipolar truncation. Complementary, long mixing time 13C-13C correlation experiments were performed on a diluted (1:4) and an uniformly labelled sample. Four ambiguous long-range cross-peaks were observed in these spectra. They could contain information on the tertiary fold of the molecules within the fibrils. Four ambiguous distance restraints were created from these cross-peaks and used in a first structure calculation with the computer program Cyana. Moreover, based on the analysis of secondary structure and the varying intensity of Cα-Cβ crosspeaks in short mixing time PDSD spectra, two more structural models were created.In der vorliegenden Dissertation wurde die Methode der Festkörper-NMR-Spektroskopie auf eine spezifische Fragestellung aus dem Bereich der Proteinfehlfaltungskrankheiten angewendet. Zu den Krankheiten, die mit der Fehlfaltung von Proteinen zusammenhängen, gehören unter anderem Diabetes Mellitus Typ 2, die Alzheimersche Demenz und die Parkinson-Krankheit. Das gemeinsame Kennzeichen dieser Gruppe von Krankheiten ist die extrazelluläre Ablagerung von fehlgefalteten Proteinen, entweder lokal in einem betroffenen Organ, oder systemisch im ganzen Körper. Der Prozess der Proteinfehlfaltung führt häufig zu der Bildung von unlöslichen, amyloiden Fibrillen. Amyloide Fibrillen, die aus verschiedenen Proteinen gebildet wurden, weisen eine geordnete, repetitive Struktur auf, die einen hohen Anteil an β-Sekundärstruktur hat. Die Aufklärung der Fibrillenstrukturen verschiedener Proteine auf molekularer Ebene ist einer der Forschungsschwerpunkte im Rahmen der Erforschung der Proteinfehlfaltungskrankheiten. Das Thema der vorliegenden Dissertation war die Untersuchung der Struktur von fibrillärem Amylin, oder auch Insel-Amyloid-Polypeptid (IAPP), mittels Festkörper-NMR-Spektroskopie. IAPP besteht aus 37 Aminosäureresten und wird zusammen mit Insulin von den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse gebildet. In physiologischer Form ist IAPP löslich und intrinsisch ungeordnet, jedoch hat es eine starke Tendenz zur Aggregation und zur Bildung unlöslicher Fibrillen. Amyloidablagerungen in der Bauchspeicheldrüse, die hauptsächlich aus IAPP bestehen, korrelieren mit Diabetes Mellitus Typ 2 (DM2) und finden sich in 90% der von DM2 betroffenen Patienten. Humanes IAPP hat eine Disulfidbrücke im N-Terminus und einen amidierten C-Terminus. Das in dieser Studie rekombinant hergestellte Peptid verfügt über die Disulfidbrücke, jedoch über einen freien C-terminus. Es wird somit als IAPP(COOH) bezeichnet. Für die Untersuchung von fibrillären Strukturen eignet sich die Festkörper-NMR-Spektroskopie, da diese Methode es ermöglicht, Fibrillen aus Proteinen voller Länge zu untersuchen. Für diese Art von Proben sind sowohl Kristallstrukturanalyse als auch Flüssig-NMR-Spektroskopie nicht geeignet, da die Proben nicht kristallin und zudem nicht löslich sind. Die Untersuchung von Biomolekülen mit NMR-Spektroskopie basiert auf der Detektion der NMR-aktiven Isotope 1H, 13C, und 15N. Informationen zu Sekundär- und Tertiärstruktur des Proteins sind in den chemischen Verschiebungen und in der Stärke von Dipolkopplungen enthalten. Die NMR-Experimente an fibrillärem IAPP haben zu einer vollständigen Zuordnung der Resonanzsignale in den NMR-Spektren geführt. Mit den so erhaltenen chemischen Verschiebungen wurde eine Analyse der Sekundärstruktur durchgeführt. Für die Hauptkonformation wurden drei β-Stränge gefunden, die auch das amyloidogene Segment 22NFGAILS28 enthalten. Der N-Terminus zeigte bei Temperaturen um 0°C gut aufgelöste und intensive Signale. Diese verbreiterten sich bei Kühlung auf -170 °C stark und waren nicht mehr zu detektieren. Diese Ergebnisse wurden 2016 im Journal PLoS One veröffentlicht. Darauffolgende Experimente zielten auf das Finden von räumlichen dipolaren Kopplungen, die Informationen über die Tertiärstruktur der Moleküle in der Fibrille enthalten. Dafür wurden zwei neue Proben hergestellt, die auf einer Verdünnung der 13C markierten Kerne in der Probe basieren. Die Verdünnung der markierten Spins ermöglicht die Detektion von schwachen dipolaren Kopplungen, die in einer voll markierten Probe durch den Effekt der Dipolar Truncation überschattet werden. Zusätzlich wurden 13C-13C Korrelationsexperimente mit langer Mischzeit an einer voll markierten und einer verdünnt markierten (1:4) Probe durchgeführt, ebenfalls mit dem Ziel, räumliche Kontakte zu detektieren. Es wurden vier Korrelationen beobachtet, die einen Aufschluss über die räumliche Struktur der IAPP Moleküle in der Fibrille geben können. Diese vier noch uneindeutigen Korrelationen wurden als begrenzende Bedingungen für eine erste Strukturberechnung mit dem Programm Cyana verwendet. Zudem wurden, basierend auf der zuvor durchgeführten Sekundärstrukturanalayse und aufgrund variierender Intensitätsverteilungen von Cα-Cβ Korrelationen in PDSD Spektren, zwei weitere mögliche Strukturmodelle erstellt. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 31.07.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 31.07.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 17.05.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.07.2017 |
