Dokument: Novel cryo-EM image processing methods to address conformational heterogeneity

Titel:	Novel cryo-EM image processing methods to address conformational heterogeneity
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42894
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170725-101245-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Spiegel, Michaela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 170,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.07.2017 / geändert 18.07.2017
Beitragende:	Jun.-Prof. Dr. Schröder, Gunnar [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Kryoelektronenmikroskopie, Konformationsänderung, Ribosom, Bildprozessierung, Einzelteilchenanalyse
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik
Beschreibungen:	Single particle analysis (SPA) using cryo-electron microscopy is a technique in structural biology, which has become increasingly important in the last 5 years. Hardware, software, and sample preparation have improved so much that more and more structures at resolutions better than 3 Å can be resolved. In this case, arbitrarily large complexes can be examined. Microscopic images of frozen individual proteins and protein complexes are snapshots of biological machines in the near native state. Depending on the sample, a more or less wide range of structural variability is typically present in the data. These are composition mixtures and conformational changes. This has an enormous potential to investigate and interpret biologically complexes in different functional states. For this purpose, however, it is necessary to classify the data, which is a difficult problem because of the very low signal-to-noise ratio. Therefore, dealing with heterogeneity in cryo electron microscopy is still a topical issue. In this thesis a new method was developed with which data can be sorted into classes of different conformations. This method is based on a principal motion analysis. In this method, the density variance of the data is determined by a statistical random resampling technique (bootstrapping) and transformed into a structural variance. After different density volumes have been reconstructed from the classified images, they can be imaged on top of each other by a flexible bending along the calculated main motions. This makes it possible to average these bent density volumes and thus to achieve a higher resolution density volume which contains all images. The two methods for sorting and bending density volumes were developed and tested on a simulated data set. Subsequently, they were applied to cryo-electron microscopy data of the E. coli 70S ribosome with tRNA sec and co-factor selB.The different steps of the data analysis were then validated in different ways. Finally, for both data sets several reconstructions in different conformational states could be reconstructed. Subsequently, a method was developed with the aid of which the different density volumes can be bent back to the mean starting volume. The deflection of the atomic structure has already been determined by the principal motion analysis. The eigenvector which acts on the atomic structure is now applied to the grid of the respective density volume. After the density volumes have been bent back, they can be weighted with the Fourier-Shell correlation and a density volume containing all images can be calculated. However, the resolution and information in the density volume has improved. This method was applied to the density volumes and eigenvectors from the two data sets we have previously sorted and an optimization of the density volume to the output volume could be shown. Density maps reconstructed from cryo-EM data are often unsharp and detailed structural features are not clearly recognizable. This is due to different factors of the experiment, e.g. mechanical vibrations. In this work, a new method was developed. We use statistical information about proteins and apply this information to the density volumes in real and Fourier space. Density maps in different resolution ranges can be improved by this method which means the volume gets sharper, structural features are better to recognize and generally the density distribution is more balanced out. Die Einzelteilchen Analyse mithilfe von Kryoelektronenmikroskopie ist eine Technik in der Strukturbiologie die gerade in den letzten 5 Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen hat. Hardware, Software und Probenherstellung sind inzwischen soweit, dass immer mehr Strukturen mit hohen Auflösungen besser als 3 Å bestimmt werden können. Hierbei können beliebig große Komplexe untersucht werden. Mikroskopische Aufnahmen von eingefrorenen einzelnen Proteinen und Proteinkomplexen sind Schnappschüsse von biologischen Maschinen in annähernd nativem Zustand. Je nach Probe ist eine mehr oder wenige breite Palette von struktureller Variabilität in den Daten vorhanden. Dies sind Kompositionsmischungen und Konformationsänderungen. Dies birgt ein enormes Potential biologische Komplexe in unterschiedlichen funktionalen Zuständen zu untersuchen und biologisch zu interpretieren. Hierzu ist es allerdings notwendig die Daten zu klassifizieren was aufgrund des sehr niedrigen Signal-zu-Rausch Verhältnisses ein schwieriges Problem darstellt. Daher ist der Umgang mit Heterogenität in der Kryoelektronenmikroskopie immer noch ein hochaktuelles Thema. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode entwickelt, mit der sich Daten in Klassen unterschiedlicher Konformationsänderungen sortieren lassen. Diese Methode basiert auf einer Hauptbewegungsanalyse. Bei diesem Verfahren wird durch eine statistische Stichprobenwiederholungstechnik (Bootstrapping) die Dichtevarianz der Daten bestimmt und in eine strukturelle Varianz transformiert. Nachdem unterschiedliche Dichtevolumen aus den klassifizierten Aufnahmen rekonstruiert worden sind, lassen sich diese durch ein flexibles Verbiegen entlang der berechneten Hauptbewegungen aufeinander abbilden. Hierdurch ist es möglich über diese verbogenen Dichtevolumen zu mitteln und somit wieder zu einem höher aufgelöstes Dichtevolumen zu gelangen, welches alle Bilder enthält. Die beiden Methoden zum Sortieren und Verbiegen von Dichtevolumen wurden an einem simulierten Datensatz entwickelt und getestet. Anschliessend wurden sie auf Kryoelektronenmikroskopie Daten angwandt, die das Escherichia coli 70S-Ribosom mit tRNA sec und co-Faktor SelB enthielten. Die verschiedenen Schritte der Datenanalyse wurden dann auf unterschiedliche Weise validiert. Letzendlich konnten für beide Datensätze Dichtevolumen in unterschidelichen konformellen Zuständen berechnet werden. Anschliessend wurde noch an einer Methode gearbeitet, mit deren Hilfe sich die unterschiedlichen Dichtevolumen wieder auf das mittlere Startvolumen zurück biegen lassen. Die Verbiegung der atomaren Struktur ist durch die Hauptbewegungsanalyse bereits bestimmt worden. Der Eigenvektor, welcher auf die atomare Struktur wirkt, wird nun auf das Gitter des jeweiligen Dichtevolumens angewandt. Nachdem die Dichtevolumen zurückgebogen wurden, können diese gewichtet mit der Fourier-Shell Korrelation aufsummiert werden und so wieder ein Dichtevolumen, welches alle Aufnahmen enthält, berechnet werden. Die Auflösung und Information in dem Dichtevolumen hat sich allerdings verbessert. Diese Methode wurde auf die Dichtevolumen und Eigenvektoren aus den beiden Datensätzen die wir zuvor sortiert haben angewandt, und eine Verbesserung des gemittelten Dichtevolumens im Vergleich zum Ausgangsvolumen konnte gezeigt werden. Aus Kryo-EM Daten rekonstruierte Dichtevolumen sind oft unscharf und detaillierte Strukturmerkmale sind nicht klar erkennbar. Dies liegt an unterschiedlichen Faktoren des Experimentes wie z.B. mechanische Vibrationen. In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zum schärfen dieser Dichten entwickelt. Hierbei nutzen wir statistische Informationen die wir über Proteine haben und wenden diese auf Dichtevolumen im Real- und Fourierraum an. Dichtevolumen von Proteinen in unterschiedlichen Auflösungsbereichen lassen sich durch dieses Verfahren optimieren, d.h. die Volumen sind schärfer aufgelöst, Strukturmerkmale sind besser zu erkennen und allgemein ist die Dichteverteilung stärker ausbalanciert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Physik » Theoretische Physik
Dokument erstellt am:	25.07.2017
Dateien geändert am:	25.07.2017
Promotionsantrag am:	19.06.2017
Datum der Promotion:	04.07.2017