Dokument: Strukturelle und funktionelle Analyse der Pyruvat-Phosphat Dikinase

Titel:	Strukturelle und funktionelle Analyse der Pyruvat-Phosphat Dikinase
Weiterer Titel:	Structural and functional analysis of pyruvate phosphate dikinase
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42842
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170717-093011-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Minges, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 72,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.07.2017 / geändert 13.07.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Stichwörter:	PPDK, Pyruvat-Phosphat Dikinase, C4, Photosynthese, Kinase, Struktur
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 580 Pflanzen (Botanik) 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die PPDK ist ein vielseitiges Enzym, welches die reversible Umwandlung von Pyruvat, Orthophosphat (Pi ) und Adenosintriphosphat (ATP) zu Phosphoenolpyruvat (PEP), Pyrophospat (PPi ) und Adenosinmonophosphat (AMP) katalysiert. Es spielt eine Rolle als glykolytisches Enzym einiger Bakterien und Protozoen, wo es in die ATP bildende Richtung arbeitet und somit die Energieeffizienz erhört. In C4-Pflanzen hingegen wird Pyruvat unter ATP-Verbrauch in PEP umgewandelt und der primäre CO2-Akzeptor PEP regeneriert. Die PPDK ist somit eines der geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme der C4-Photosynthese. Die Übertragung einer Phosphorylgruppe zwischen den weit auseinander liegenden Substratbindedomänen erfolgt über den so genannten Swiveling Domain-Mechanismus, bei dem die Zentraldomäne (Central Domain, CD) eine Schwenkbewegung durchläuft. Über Zwischenkonformationen, welche diese CD im katalytischen Zyklus möglicherweise einnimmt, waren bislang allerdings keinerlei Erkenntnisse verfügbar. Der Bindungsmodus von Nukleotiden innerhalb der NBD und deren Öffnungs- und Schließbewegung bei Substratbindung waren nicht abschließend geklärt und nur in Analogie zu Proteinen mit homologer NBD postuliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Kristallstrukturen der PPDK aus der C4-Pflanze Flaveria trinervia, sowie der C3-Pflanze Flaveria pringlei gelöst, welche detaillierte Einblicke in die Domänenbewegungen der PPDK in ihrem katalytischen Zyklus ermöglichen. Es wurden zwei bislang unbekannte intermediäre Konformationen der CD beschrieben, wodurch gezeigt werden konnte, dass die Bewegung der CD nicht linear interpoliert zwischen zwei definierten Extermkonformationen, sondern stattdessen über isolierbare Zwischenstufen abläuft. Weiterhin wurden geschlossene nukleotidgebundene und offene nukleotidfreie Konformationen der NBD gefunden, welche möglicherweise auf einen alternierenden Mechanismus der Substratbindung und -freisetzung im funktionellen Homodimer/-tetramer hindeuten. Abschließend wurde eine Bibliothek von bekannten Kinaseinhibitoren auf ihre Wirksamkeit bezüglich der PPDK hin getestet. Hierbei konnten für die PPDK bislang unbekannte hocheffiziente Inhibitoren aus der Klasse der Bisindolylmaleimide identifiziert werden. Ein vergleichendes in silico Docking zeigte das Potential einer strukturellen Anpassung dieser Inhibitoren mit dem Ziel einer erhöhten Selektivität in Bezug auf die PPDK auf. The pyruvate phosphate dikinase (PPDK) is a versatile enzyme which catalyzes the reversible interconversion of pyruvate, inorganic phosphate (Pi ) and adenosine triphosphate (ATP) to phosphoenolpyruvate (PEP), pyrophosphate (PPi ) and adenosine monophosphate (AMP). PPDK is involved in the energy metabolism of several bacteria and protists as a glycolytic enzyme where it acts in the ATP-forming direction, boosting the energy efficiency of these organisms. The PEP-forming direction is used in C4 plants where the primary CO2 acceptor PEP is regenerated by PPDK. Hence, PPDK is one of the rate-limiting enzymes of C4 photosynthesis. Phosphoryl group transfer between the distant substrate binding domains is realized by the so-called swiveling domain mechanism which employs a swiveling movement of the central domain (CD). However, intermediate conformations of the CD have been unresolved so far. Similarly, the binding mode of nucleotides within the nucleotide binding domain (NBD) and the opening and closing motion of this domain were only postulated in analogy to other proteins with homologous nucleotide binding domains. A possible crosstalk between monomers in the functional homodimer or homotetramer has not been investigated so far. In the course of this work, a number of novel crystallographic structures of PPDK from the C4 plant Flaveria trinervia and the C3 plant Flaveria pringlei have been solved. These allow to derive a more detailed view on the domain movements of PPDK in its catalytic cycle. Two conformational intermediates of the CD have been trapped which show that the swiveling movement of the CD does not proceed in a linear interpolation between two extreme conformations, but instead proceeds via distinct sub-steps. Additionally, nucleotide-bound (closed) and nucleotide-free (open) conformations of the NBD were identified in these structures. This hints at a possible alternate binding change mechanism employed in the functional dimeric or tetrameric assembly. Eventually a library of known kinase inhibitors was screened for inhibitory effects on PPDK. During this study, novel high efficacy inhibitors of PPDK have been identified which belong to the class of bisindolylmaleimides. A comparative in silico docking approach revealed high potential for structural adjustment of these inhibitors with the aim of an improved selectivity towards PPDK.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	17.07.2017
Dateien geändert am:	17.07.2017
Promotionsantrag am:	13.02.2017
Datum der Promotion:	28.03.2017