Dokument: Untersuchungen zur Acylierung, Struktur und Glykanbindung des RTX-Toxins Hämolysin A aus Escherichia coli

Titel:	Untersuchungen zur Acylierung, Struktur und Glykanbindung des RTX-Toxins Hämolysin A aus Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42806
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170705-094720-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Peherstorfer, Sandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,38 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.07.2017 / geändert 05.07.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Däubener, Walter [Gutachter]
Stichwörter:	Hämolysin, Häm, RTX-Toxin, Acyltransferase, Harnwegsinfektion, Escherichia coli
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Hämolysin A (HlyA) ist ein Proteintoxin aus uropathogenen Escherichia coli und gehört zur Familie der sekretierten Repeats-In-Toxin (RTX) Toxine. Diese Proteinfamilie aus Gram-negativen Bakterien zeichnet sich durch das Vorhandensein eines charakteristischen, Calciumionen-bindenden Motives sowie der Sekretion durch ein Typ 1 Sekretionssystem aus. Die biologischen und biochemischen Funktionen von RTX-Toxinen reichen von zytolytischen bis hin zu proteolytischen und anderen enzymatischen Aktivitäten. HlyA aus uropathogenen Escherichia coli besitzt hämolytische, zytolytische sowie zytotoxische und immunregulatorische Wirkungen auf unterschiedliche Wirtszellen. Für die Aktivierung, des als Protoxin hergestellten, Toxins ist die intrazelluläre, bakterielle Acyltransferase Hämolysin C (HlyC) verantwortlich. Dabei katalysiert HlyC den posttranslationalen Transfer von Acylgruppen von dem Acylgruppen-tragenden Protein (ACP) auf zwei spezifische Lysinseitenketten des Protoxins. Diese Dissertation beschäftigt mit der Regulation der Acyltransferaseaktivität von HlyC durch Eisen-Protoporphyrin IX (Fe-PPIX, Häm/Hämin) sowie der Strukturaufklärung und Funktionsanalyse von HlyA in Zusammenhang mit einer möglichen Bindung an Zelloberflächenglykane. Das erste Kapitel beschäftigt sich mit der Wirkung von Häm auf die Enzymaktivität von HlyC mit Bedeutung in Hinblick auf die hämolytische Aktivität von HlyA. Grundlage bildete die Beobachtung der Bindung von Häm an ein postuliertes, Häm-regulierendes Peptidmotiv, welches in der Aminosäuresequenz von HlyC vorhanden ist. Nachdem die Bindung von Häm auf Proteinebene bestätigt werden konnte, wurde in dieser Arbeit ein bereits etablierter in vitro Acylierungsassay für die Untersuchungen der Acyltransferaseaktivität in Anwesenheit von Hämin adaptiert. Durch die Aktivitätsmessungen des gereinigten Proteins mit Hämin konnte eine inhibitorische Wirkung von Hämin auf die Enzymaktivität von HlyC gezeigt werden. Der IC50-Wert für Hämin liegt mit 5 μM im Bereich der bereits früher, für andere durch Hämin gehemmten Enzyme, erhobenen Daten. Weiterhin wurde durch eine zielgerichtete Mutagenese das postulierte Häm-Bindemotiv in HlyC verändert und die Aktivitätsmessungen wiederholt. Zwei potentielle Koordinationsstellen im postulierten Häm-Bindemotiv konnten dadurch jedoch nicht bestätigt werden und mögliche weitere Koordinationsstellen in HlyC müssen in Betracht gezogen werden. Kapitel zwei und drei beschäftigen sich mit der Struktur- und Funktionsanalyse von HlyA. Im Fokus stehen die Kristallisation des Protoxins sowie die Untersuchung einer möglichen Bindung des Protoxins an die Oberflächenglykane von Wirtszellen. Trotz erfolgreicher Kristallisation des Proteins im Rahmen dieser Dissertation, sind weitere Optimierungsschritte zur Verbesserung der Kristallqualität und Bestimmung der dreidimensionalen Raumstruktur von HlyA nötig. Hinweise auf eine mögliche Erkennung von Zuckerstrukturen auf den Zielzellen durch HlyA stammen aus bereits früher publizierten Forschungsarbeiten. Um daher die Rolle von Glykanen bei der Interaktion von HlyA mit (humanen) Zielzellmembranen zu untersuchen, wurde das gereinigte Protoxin zunächst über ein eingebautes Cystein mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Weitere Analysen mit dem markierten Protein konnten eine zuckerabhängige Bindung an Nierenepithelzellen und Glykosphingolipide nicht bestätigen. Weiterhin zeigte das markierte proHlyA in einem zur Identifizierung von Zuckerinteraktionspartnern durchgeführten Glykan Array nur sehr schwache Bindungen an die getesteten Glykane. Über deren Bedeutung in vivo kann an dieser Stelle noch keine Aussage getroffen werden. In dieser Dissertation wurden die zwei Proteine HlyA und HlyC aus uropathogenen Escherichia coli charakterisiert, die im Verlauf von Harnwegsinfektionen eine wichtige Rolle spielen. Ergebnisse daraus können möglicherweise auf andere RTX-Toxine übertragen werden und sind dadurch möglicherweise in einer Vielzahl von Infektionen relevant. Hemolysin A (HlyA) is a protein toxin from uropathogenic Escherichia coli strains that belongs to the family of secreted repeats-in-toxin (RTX) toxins. This protein family from Gram-negative bacteria is characterized by the existence of a characteristic calcium ion binding motif and the secretion via a type 1 secretion system. The biological and chemical functions of RTX toxins include not only cytolytic but also proteolytic and other enzymatic activities. HlyA from uropathogenic Escherichia coli exhibits hemolytic, cytolytic as well as cytotoxic and immunregulatory functions on different host cells. For the activation of the protoxin proHlyA, the intracellular bacterial acyltransferase Hemolysin C (HlyC) is required. HlyC catalyzes the posttranslational transfer of acyl groups from the acyl-carrier protein (ACP) onto two specific lysine residues of the protoxin. This doctoral thesis is dedicated to the regulation of the acyltransferase activity of HlyC by iron protoporphyrin IX (Fe-PPIX, heme/hemin) as well as the structure determination and functional analysis of HlyA in the context of a potential binding on cell surface glycans. The first chapter deals with the effect of heme on the enzymatic activity of HlyC with regard to the hemolytic activity of HlyA. The observation of heme binding to a postulated heme-regulating peptide motif in the amino acid sequence of HlyC provided the basis for this research. After confirming the binding of heme on the protein level, an established in vitro acylation assay was successfully adapted for the investigation of the acyltransferase activity in presence of heme in the course of this thesis. By measuring the activity of the purified protein together with hemin, an inhibitory effect of hemin on the enzymatic activity of HlyC could be shown. The IC50-value for hemin of 5 μM is in the range of already published data for other enzymes inhibited by hemin. Furthermore, the postulated binding motif in HlyC was modified using site-directed mutagenesis and the activity measurements were repeated. Thereby, two potential coordination sites in the postulated heme-binding motif, however, could not have been confirmed and other potential coordination sites in HlyC must be considered. Chapters two and three are dedicated to the structural and functional analysis of HlyA. The focus here are the crystallization of the protoxin and the exploration of a proposed binding of the toxin to surface glycans on host cells. Although the protein was successfully crystallized in the course of this thesis, further optimization steps are required to increase the crystal quality and determine the three-dimensional structure of HlyA. Indications for a potential recognition of sugar structures on the target cells by HlyA are provided in literature. To elucidate the role of glycans in the interaction of HlyA with (human) cell membranes, the purified protoxin was fluorescently labeled via an artificial cysteine. Further analysis with the labeled protein, however, could not confirm a binding to kidney epithelial cell or glycosphingolipids. Moreover, only weak binding of proHlyA was observed with the tested glycans in a glcyan array destined to identify sugar-based interaction partners. No statement about the relevance of these interactions in vivo can be made yet. In summary, the two proteins HlyA and HlyC from uropathogenic Escherichia coli strains, which play an important role in the course of urinary tract infections, were characterized in this thesis. Results from that may be transferred to other RTX toxins and may become relevant in multiple other infections in the future.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	05.07.2017
Dateien geändert am:	05.07.2017
Promotionsantrag am:	12.04.2017
Datum der Promotion:	31.05.2017