Dokument: Nuclear magnetic resonance insights into membrane and cellular systems
| Titel: | Nuclear magnetic resonance insights into membrane and cellular systems | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42686 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170621-111725-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr Viennet, Thibault [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | nuclear magnetic resonance; dynamic nuclear polarization; lipid bilayer nanodiscs; membrane proteins | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Structural biology has benefited in the past years from both the improvement in biochemical procedures (protein expression, purification and modification, membrane protein refolding systems, etc.) and the development of powerful and complementary biophysical techniques allowing to study structures, dynamics and interactions. Certain particularly relevant biological systems, however, still remain difficult to study, including dynamics in big biomolecules, structure of membrane proteins, and structural information of proteins in their native environments. For this reason, further improvements in both biochemical and biophysical techniques still need to be implemented.
One of these techniques, nuclear magnetic resonance (NMR) has a high potential and applicability in the study of structure, dynamics and interactions of biomolecules. Nevertheless it also faces limitations, some of which we propose to tackle in this work. This includes a new way of acquiring solution NMR data in a more time efficient manner (Chapter IV), allowing to get additional, complementary, information during the acquisition of conventional experiments. Moreover, in Chapter V we introduce specific hyperpolarization using dynamic nuclear polarization (DNP) NMR in order to specifically detect a target protein in its cell lysate. This overcomes the need for sample purification and drastically reduces the amount of protein needed. Furthermore, sample preparation is critical in all NMR studies, and gets particularly challenging in the case of membrane proteins. Suitable membrane mimicking systems have still to be implemented, with the difficulty of being suitable for the chosen NMR method while providing a native environment for the target protein. In particular, lipid bilayer nanodiscs appear as an interesting alternative to conventional membrane mimetics. We review the biochemistry and the NMR applications of nanodiscs in Chapter III, and show initial results towards better understanding of their arrangement and behavior. We apply this methodology to the study of the membrane protein Barttin, an ion channel regulator, and compare the results with more conventional detergent micelles in Chapter VII. Moreover, nanodiscs allowed us to characterize the membrane association mechanisms of the Parkinson’s disease relevant protein α-Synuclein and their effect on fibril formation in Chapter VI. Ultimately, we bring together the nanodisc system and the specific hyperpolarization of targeted DNP with the aim of developing a universal platform for the study of membrane proteins by magic angle spinning solid-state NMR. One advantage of this platform could be the characterization of low-populated states in membrane-associated systems.Die Strukturbiologie hat in den letzten Jahren große Fortschritte in der (Weiter)Entwicklung sowohl biochemischer Verfahren, als auch komplementärer biophysikalischer Methoden zur Untersuchung der Struktur, Dynamik und Interaktion von Biomolekülen gemacht. Dennoch bleiben einige Systeme, wie z.B. Membranproteine und Protein in ihrer zellulären Umgebung, immer noch schwer zugänglich. Daher sind weitere Fortschritte in biochemischen und biophysikalischen Techniken in diesen Bereichen immer noch äußerst wichtig. Die Kernmagnetische-Resonanzspektroskopie (NMR) bietet generell ein großes Potential für die Untersuchung der Struktur, Dynamik und Interaktionen von Proteinen. Es existieren jedoch auch deutliche Limitierungen der Technik. In dieser Arbeit widmen wir uns einigen dieser Limitierungen sowie Möglichkeiten diese zu überwinden. Ein Beispiel hierfür ist die von uns entwickelte effizientere Aufnahme von Lösungs-NMR Spektren, welche einen höheren Informationsgehalt der Messdaten ermöglicht (s. Kapitel IV). Zusätzlich führen wir selektive Hyperpolarisation mittels dynamischer Kernpolarisation (DNP) ein (s. Kapitel V). Dieses Verfahren ermöglicht die spezifische Detektion eines Zielproteins direkt in Zelllysaten und beseitigt weitestgehend die Notwendigkeit der Proteinaufreinigung. Generell stellt die Probenpräparation ein zentrales Element für NMR Untersuchungen da. Diese kann jedoch, insbesondere für Membranproteine, zu einer großen Herausforderung werden, da geeignete membranmimetische Umgebungen verwendet werden müssen, welche auf der einen Seite zugänglich für die verwendeten NMR Methoden sein sollen und auf der anderen Seite eine möglichst native Umgebung für das Zielprotein darstellen sollen. In diesem Zusammenhang bieten sogenannte Nanodiscs, bestehend aus einer Lipiddoppelschicht, eine interessante Alternative gegenüber anderen konventionellen Membranmimetica. Kapitel III dieser Arbeit gibt eine Übersicht über die Biochemie sowie NMR Anwendungen von Nanodiscs und gibt Anhaltspunkt für ein besseres Verständnis der Anordnung und des Verhaltens dieses Systems. Kapitel VII zeigt eine Anwendung der Nanodisctechnologie, sowie einen Vergleich mit eher konventionellen Detergenzmizellen, für die Untersuchung des Membranproteins Barttin, welches als Regulator verschiedener Ionenkanälen fungiert. Des Weiteren konnten wir mittels Nanodiscs die Membraninteraktion des Parkinsons assoziierten Proteins α-Synuclein und deren Effekt auf die krankheitsrelevante Fibrillenausbildung charakterisieren (Kapitel VI). Abschließend kombinieren wir die Potentiale des Nanodiscsystems und der spezifische Hyperpolarisation, um eine allgemein verwendbare Plattform zur Untersuchung von Membranproteinen mittels DNP-Festkörper-NMR zu entwickeln, welche u.a. die Möglichkeit eröffnen sollte niedrig besetzte Zustände in Membransystemen besser zu untersuchen. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.06.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 21.06.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 21.04.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.05.2017 |
