Dokument: Regulation of the activity of the Escherichia coli ABC transporter haemolysin B

Titel:	Regulation of the activity of the Escherichia coli ABC transporter haemolysin B
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42630
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170613-112244-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Reimann, Sven [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 48,06 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.06.2017 / geändert 12.06.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Promotion, Sven Reimann, Biochemie, Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The toxin haemolysin A (HlyA) is associated with the majority of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains, which cause severe diseases in human. HlyA belongs to the repeats in toxin (RTX) superfamily and is one of the virulence factors, which is secreted by the type 1 secretion system (T1SS) of Gram negative bacteria. The T1SS nanomachinery is composed of three proteins, the outer membrane protein TolC, the membrane fusion protein haemolysin D (HlyD) and the ATP-binding cassette (ABC) transporter haemolysin B (HlyB). Substrates of the T1SS are transported in an unfolded state across both membranes and without the formation of periplasmic intermediates. Here, the ABC transporter HlyB fulfils a central role during the translocation of the toxin. HlyB is located in the inner membrane of the bacterial cell envelope and it is supposed to energize the translocation mechanism by the consumption of ATP. Therefore, the activity of the protein is supposed to be strictly regulated to prevent futile ATP hydrolysis. Aside from the canonical nucleotide-binding domain and the transmembrane domain, HlyB contains a C39 peptidase like domain (CLD). This additional domain is essential for the secretion process of HlyA, however, its precise role and mechanism is not understood in every detail until now. This doctoral research investigates the regulation of the activity of HlyB and thereby contributes to a more detailed fundamental understanding of the HlyA T1SS translocation machinery. In order to investigate HlyB in vitro, a protocol was established to purify, store and characterise the protein. It could be demonstrated, that the solubilised ABC transporter exhibits a positive cooperativity in ATP hydrolysis. In addition, the CLD of HlyB was analysed in this context and it was found to significantly reduce HlyB basal ATPase activity, whereas it does not affect the substrate-binding affinity. It was concluded that the CLD assumes a regulatory role with an autoinhibitory function. Furthermore, it was found that HlyB ATPase activity is inhibited or stimulated depending on HlyA concentration and this modulation is generally independent of the secretion signal. By a mutational analysis it was shown that the CLD mediates HlyB ATPase inhibition by an interaction with the substrate. Additional cross-linking experiments suggested that the transmembrane domain also interacts with the substrate and thereby mediating ATPase stimulation. These studies also suppose that both, ATPase inhibition and stimulation, go along with distinct conformational arrangements of HlyB domains. This doctoral research also deals with the characterisation of the HlyA RTX domain and its influence on the regulation of HlyB. It could be shown that the RTX repeats, a subunit of the RTX domain, interact with the CLD of HlyB and thereby inducing ATPase inhibition. Additionally, it was shown that the most C-terminal RTX repeat is also involved in ATPase stimulation, which might be connected to a predicted α-helical secondary structure located close to this region. Das Toxin Hämolysin A (HlyA) ist mit einem Großteil uropathogener Escherichia coli (UPEC) Stämme assoziiert, welche schwere Erkrankungen des Menschen verursachen. HlyA gehört zu der repeats in toxin (RTX) Superfamilie und ist einer der Virulenzfaktoren, die vom Typ 1 Sekretionssystem (T1SS) Gram-negativer Bakterien sekretiert werden. Die T1SS Nanomaschinerie ist aus drei Proteinen zusammengestellt, dem äußeren Membranprotein TolC, dem Membranfusionsprotein Hämolysin D (HlyD) und dem ATP-binding cassette (ABC) Transporter Hämolysin B (HlyB). Die Substrate des T1SS werden in einem ungefalteten Zustand und ohne die Ausbildung eines periplasmatischen Zwischenproduktes über beide Membranen transportiert. Hierbei übernimmt der ABC Transporter HlyB eine zentrale Rolle während der Translokation des Toxins. HlyB ist in der inneren Membran der bakteriellen Zellhülle lokalisiert und es wird angenommen, dass es den Translokationsmechanismus durch den Verbrauch von ATP energetisiert. Daher wird postuliert, dass die Aktivität des Proteins strengstens reguliert wird, um sinnlose ATP Hydrolyse zu verhindern. Außer der kanonischen Nukleotidbindedomäne und der Transmembrandomäne, beinhaltet HlyB eine C39-Peptidase ähnliche Domäne (CLD). Diese zusätzliche Domäne ist essentiell für den Sekretionsprozess von HlyA, dennoch ist dessen präzise Rolle und Mechanismus bisher nicht in allen Einzelheiten verstanden. Diese Doktorarbeit erforscht die Regulation der Aktivität von HlyB und trägt dadurch zu einem detaillierteren fundamentalen Verständnis der HlyA T1SS Translokationsmaschinerie bei. Um HlyB in vitro zu erforschen, wurde ein Protokoll etabliert, um das Protein zu reinigen, zu lagern und zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass der solubilisierte ABC Transporter eine positive Kooperativität bezüglich der ATP-Hydrolyse aufweist. Zusätzlich wurde in diesem Kontext die CLD von HlyB analysiert und es wurde festgestellt, dass sie die basale HlyB ATPase Aktivität signifikant reduziert, wohingegen sie die Substrat Bindungsaffinität nicht beeinflusst. Daraus wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die CLD eine regulatorische Rolle mit einer autoinhibitorischen Funktion übernimmt. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die HlyB ATPase Aktivität in Abhängigkeit von der HlyA Konzentration inhibiert oder stimuliert wird und diese Modulation ist generell unabhängig vom Sekretionssignal. Mittels einer Mutationsanalyse wurde gezeigt, dass die CLD die HlyB ATPase Inhibition durch eine Interaktion mit dem Substrat vermittelt. Zusätzliche cross-linking Experimente suggerierten, dass die Transmembrandomäne ebenfalls mit dem Substrat interagiert und dadurch die ATPase Stimulation vermittelt. Diese Studien lassen auch vermuten, dass die ATPase Inhibition und Stimulation mit unterschiedlichen konformationellen Anordnungen der HlyB Domänen einhergehen. Diese Doktorarbeit handelt auch von der Charakterisierung der HlyA RTX Domäne und deren Einfluss auf die Regulation von HlyB. Es konnte gezeigt werden, dass die RTX repeats, eine Untereinheit der RTX Domäne, mit der CLD von HlyB interagieren und dadurch die ATPase Inhibition induzieren. Zusätzlich wurde gezeigt, dass das C-terminalste RTX repeat ebenfalls an der ATPase Stimulation beteiligt ist, was möglicherweise mit einer vorhergesagten α-helikalen Sekundärstruktur in Verbindung steht, welche nahe dieser Region lokalisiert ist.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	13.06.2017
Dateien geändert am:	13.06.2017
Promotionsantrag am:	18.04.2017
Datum der Promotion:	16.05.2017