Dokument: Effect of long-acting insulin analogues on human cardiovascular cell models

Titel:	Effect of long-acting insulin analogues on human cardiovascular cell models
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42617
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170703-084557-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hartmann, Thorsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,83 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.06.2017 / geändert 11.06.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Eckel, Jürgen [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Stichwörter:	insulin analogues, weekly insulin, degludec, glargine, HM12470, insulin signalling
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Diabetes Mellitus stellt eine der größten Herausforderungen des Gesundheitssektors dar, mit welcher sich die westliche Welt in den nächsten Jahrzehnten konfrontiert sehen wird. Es wird erwartet, dass die Zahl der Diabetiker rapide ansteigt, was zu großen ökonomischen Belastungen und zu einer Reduzierung der Lebensqualität der Neu-Diabetiker führen wird. Wenn die Krankheit unbehandelt bleibt, kann dies für den Patienten zu lebensbedrohlichen Konsequenzen, wie zum Beispiel Ketoazidose, führen. Zusätzlich kann falscher oder unbehandelter Diabetes zu Langzeitkomplikationen wie Nephropathie, Retinopathie, Neuropathie oder kardiovaskulären Erkrankungen führen. Nur mit adäquater Behandlung der Patienten ist es möglich diese Langzeitkomplikationen zu umgehen. Zwar gibt es zurzeit verschiedene Behandlungsmöglichkeiten für Typ 2 Diabetiker, jedoch kann es sein, dass bei fortschreitendem Krankheitsbild und sich verschlechternder Prognosen eine Behandlung mit Insulinmedikamenten unumgänglich wird. Darüber hinaus ist die Behandlung mit Insulin zurzeit die einzige Möglichkeit Typ 1 Diabetiker zu therapieren. Insulin wurde im Jahr 1921 von Banting und Best zum ersten Mal isoliert. Kurz darauf wurde die erste erfolgreiche Behandlung eines Diabetikers mit tierischem Insulin durchgeführt. Mitte der 1990er Jahre wurde das erste Insulinanalog (Insulin Lispro) mit einer Veränderung der Primärstruktur zur Behandlung von Diabetikern eingeführt. Darauf folgten weitere Insulinanaloga. Diese lassen sich grob in zwei Klassen unterteilen, schnell wirksame Insulinanaloga und lang wirksame Insulinanaloga. Diese weisen im Vergleich zu regulärem Insulin vorteilhafte pharmakodynamische und pharmakokinetische Eigenschaften auf (schnelle Wirksamkeit vs. lange anhaltender Effekt). Trotz Verbesserungen der pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften sind lang wirksame Insulinanaloga nicht vollständig in der Lage, die endogene Insulinsekretion nachzuahmen. Um dies zu erzielen befinden sich zurzeit verschiedene ultra-lang wirksame Insulinanaloga in der (prä-)klinischen Entwicklung. Durch die Veränderung am Insulinmolekül kann es zu unerwünschten Nebenwirkungen kommen. So konnte für AspB10-Insulin gezeigt werden, dass dieses Insulin eine erhöhte kanzerogene Wirkung hat. Im Fall von Insulin Degludec hat die amerikanische Behörde für Lebens- und Arzneimittel (FDA) die Zulassung für den amerikanischen Markt mit der Begründung eventueller kardiovaskulärer Risiken im Zusammenhang mit der Verwendung von Insulin Degludec im Jahr 2013 zunächst untersagt. Des Weiteren forderte die FDA eine klinische Studie, die diese Risiken ausschließen soll. Um die molekularbiologischen Grundlagen für die potentiellen Nebenwirkungen von Insulin Degludec zu untersuchen wurde im ersten Teil dieser Thesis die Wirkung von Insulin Degludec auf den Insulin Signalweg und die Funktion von Kardiomyozyten mit Insulin Glargin und regulärem Insulin verglichen. Dazu wurden Kontraktionsparameter in primären Rattenkardiomyozyten sowie die Kontraktionsfrequenz in humanen Kardiomyozyten, als auch der Apoptosesignalweg und die Glukoseaufnahme im Gleichgewichtszustand untersucht. In keinem dieser Parameter konnte ein Unterschied zwischen Insulin Degludec und den anderen verwendeten Insulinen festgestellt werden. Jedoch wurde festgestellt, dass es zu einem signifikant verzögerten Wirkungseintritt im Insulin Signalweg von HL-1 Kardiomyozyten kommt, wenn diese mit Insulin Degludec behandelt wurden. Dies wurde durch die signifikant geringere Bindungsaffinität von Insulin Degludec an den Insulinrezeptor erklärt. Im zweiten Teil der Thesis wurde die Sicherheit und Wirksamkeit des neu entwickelten ultra lang wirksamen Insulinanalogs HM12470 in in vitro und in vivo Experimenten untersucht. Bei HM12470 handelt es sich um ein so genanntes Fc-Fusionsprotein. In den in vitro Experimenten wurde eine signifikant geringere Bindungsaffinität von HM12470 zum Insulinrezeptor festgestellt. Die Verweilzeit am Insulinrezeptor unterscheidet sich hingegen nicht im Vergleich zu regulärem Insulin. Darüber hinaus wurde kein Unterschied im Insulinrezeptor-Autophosphorylierungsmuster festgestellt. Einzig auf Grund der geringen Rezeptoraffinität musste die 5-fache Konzentration von HM12470 verwendet werden, um zu vergleichbaren Zeitpunkten Phosphorylierung analysieren zu können. Die Analyse der mitogenen Eigenschaften von HM12470 ergab keinen Unterschied zu regulärem Insulin, selbst wenn hohe Konzentrationen der Insuline (1000 nM) verwendet wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die metabolische Wirkung nach Kurzzeit-Stimulation (2 h) im Vergleich zu regulärem Insulin leicht reduziert war. Nach der Langzeit-Stimulation (24 h) konnte jedoch kein Unterschied zwischen beiden Insulinen festgestellt werden. Interessanterweise ist diese Beobachtung auf geringere Insulinrezeptor-Herunterregulierung nach Behandlung mit HM12470 zurückzuführen. Dies ist sogar der Fall, wenn eine 5-fach erhöhte Konzentration von HM12470 verwendet wurde. Um die Insulinrezeptor-Regulierung weiter zu untersuchen, wurde ein Desensitisierungs/Resensitisierungs-Modell entwickelt. Darin wurden die Zellen für fünf Tage mit 500 nM des jeweiligen Insulins behandelt und anschließend für bis zu zwei Tage in insulin-freiem Medium weiter kultiviert. Bei dieser Versuchsreihe konnten weitere Beweise gefunden werden, dass HM12470 die behandelten Zellen nicht dauerhaft desensitisiert. Nach fünf-tägiger Behandlung war der Insulinsignalweg in HM12470 behandelten Zellen signifikant beeinträchtigt, nach zwei Tagen ohne Insulinbehandlung zeigten die HM12470 behandelten Zellen eine nahezu vergleichbare Insulinwirkung wie die Kontrollzellen. Darüber hinaus war die Insulinwirkung auf diese Zellen signifikant besser als auf Zellen welche zuvor mit regulärem Insulin behandelt wurden. In den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass HM12470 seine Wirkung in allen Zielorganen von männlichen Wistar-Ratten erreicht. Zusätzlich wurde gezeigt, dass HM12470 eine Serum-Halbwertzeit von 44.1 h in Ratten aufweist und in der Lage ist, den Blutglukosespiegel in db/dbMäusen bis zu sieben Tage nach einer einzelnen Injektion zu normalisieren. Zusammenfassend konnte in dieser Thesis kein negativer Effekt von Insulin Degludec auf den Insulinsignalweg und die Funktion von Kardiomyozyten gezeigt werden. Zusätzlich konnte in dieser Thesis eine umfassende in vitro und in vivo Studie des Insulinanalog HM12470 präsentiert werden. Dabei zeigte sich, dass HM12470 ein substantiell verlängertes pharmakokinetisches Profil und ein sicheres metabolisches/mitogenes Profil aufweist und zusätzlich die einzigartige Eigenschaft besitzt, Zellen selbst in hohen Konzentrationen nicht irreparabel zu desensitisieren. Diese prä-klinischen Daten liefern Hinweise für die Sicherheit und Effektivität von HM12470, welche nun in klinischen Studien noch nachgewiesen werden müssen. Diabetes mellitus is one of the largest health issues the western society is facing in the coming decades. The number of diabetic patients is expected to increase rapidly, leading to high economic burdens and to decreased quality of life for the patients themselves. These patients face life threatening consequences, such as ketoacidosis, if the disease is not treated. Furthermore, long-time consequences, such as nephropathy, retinopathy, neuropathy and cardiovascular disease can occur if the patients are not treated properly. With sufficient treatment only, diabetic patients have a chance to circumvent most of the complications associated with diabetes. Today, several therapy options for the treatment of type 2 diabetes mellitus are available. However, ultimately exogenous insulin supplementation might become necessary to prevent hyperglycaemia. Furthermore, the supplementation of exogenous insulin is the only treatment option for type 1 diabetes mellitus patients to date. The first isolation of insulin was conducted by Banting and Best in 1921. Shortly after, the first diabetic patient was successfully treated with exogenous insulin supplementation. In the mid-1990s insulin lispro, the first insulin analogue with modification in its primary structure was introduced and several others followed. These insulin analogues are mainly divided into two classes: rapid- and long-acting insulin analogues, which exhibit favourable pharmacokinetic/pharmacodynamic profiles compared to regular insulin (faster onset vs. longer duration of action). However, the pharmacokinetic/pharmacodynamic profiles of long-acting insulin analogues do not mimic endogenous insulin secretion yet and novel ultra-long-acting insulin analogues are currently in (pre-)clinical development. Furthermore, the introduced modifications can lead to undesired side-effects as could be shown for insulin AspB10, which shows increased cancerogenicity. For insulin degludec the American Food and Drug Administration raised concerns about potential cardiovascular side effects and therefore requested a dedicated cardiovascular outcome trial. To analyse the molecular basis of insulin degludecs potential side-effects, the first part of this thesis was to compare insulin degludec to insulin glargine and regular insulin in regard of signalling and function on cardiomyocytes. Therefore contractility parameters of adult rat ventricular myocytes, beating-rate of human cardiomyocytes, as well as apoptotic signalling and glucose uptake under steady-state conditions were analysed. In none of these parameters a difference between the different analogues was observed. However, the onset of action in HL-1 cells was significantly slower with insulin degludec, which was explained by the significantly lower binding affinity of insulin degludec towards the insulin receptor found in this study. In the second part of the thesis in vitro and in vivo studies regarding the safety and efficacy of the novel ultra-long-acting insulin analogue HM12470, an Fc-fusion protein, were conducted. In the in vitro studies we found significantly lower binding affinities towards the insulin receptor with HM12470, but similar off-rates compared to regular insulin. No difference in the insulin receptor autophosphorylation pattern was detected, even though a 5-fold higher insulin concentration had to be used to observe onset of signalling after short-term treatment. The mitogenic potency of HM12470 was found to be comparable to regular insulin even if high concentrations (1000 nM) were used. The metabolic potency was slightly reduced after short-term stimulation (2 h). However, after long-term stimulation (24 h) with HM12470 comparable metabolic potency was observed. Interestingly, this observation was due to significantly less receptor down-regulation in the cells treated with HM12470, even with a 5-fold higher concentration. In another experiment the insulin receptor downregulation was analysed in a desensitisation/resensitisation model. Cells were treated for 5 days with 500 nM of the respective insulin. Subsequently, cells were cultivated for up to 48 h in the absence of insulin. Here further evidence was found, that HM12470 did not irreversibly desensitise the cells. After 5 days of treatment the insulin signalling was significantly reduced. After 48 h of recovery, the cells treated with HM12470 showed insulin signalling nearly comparable to the control cells. Furthermore, HM12470 treated cells showed significantly increased signalling compared to insulin treated cells at this time point. In the in vivo experiments it was demonstrated that HM12470 is able to induce insulin signalling in all major insulin target tissues in male Wistar rats. Additionally, HM12470 has a serum half-life of up to 44.1 h in rats and glucose lowering effects of up to 7 days in db/dbmice after single subcutaneous injection. In conclusion, this thesis provides no evidence for harmful effects of insulin degludec with regard to cardiomyocyte signalling and function. Furthermore, this thesis provides a comprehensive pre-clinical study of the insulin analogue HM12470. HM12470 exhibits a substantially prolonged pharmacokinetic profile with a safe metabolic/mitogenic profile and the unique feature of absence of irreversible insulin signalling desensitisation. Thus providing pre-clinical evidence for safety and efficacy of HM12470, which needs to be proven in clinical trials.
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Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Deutsches Diabetes-Zentrum
Dokument erstellt am:	03.07.2017
Dateien geändert am:	03.07.2017
Promotionsantrag am:	21.02.2017
Datum der Promotion:	02.06.2017