Dokument: Analyse der OCT4-Expression in unrestringierten somatischen Stammzellen (USSC) aus humanem Nabelschnurblut

Titel:	Analyse der OCT4-Expression in unrestringierten somatischen Stammzellen (USSC) aus humanem Nabelschnurblut
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42576
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170607-102959-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Springer, Judith [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.06.2017 / geändert 06.06.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Uhrberg, Markus [Gutachter] Prof. Dr. Niehues, Tim [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Spezifische epigenetische Signaturen, wie z.B. die DNA-Methylierung von Pluripotenzgenen wie OCT4, haben einen Einfluss auf die Genexpression und resultieren in einem zelltyp-spezifischem Transkriptionsprogramm. Somit können Zelltypen anhand ihres epigenetischen Musters und ihrer Genexpression charakterisiert werden. Der Transkriptionsfaktor OCT4 wird nahezu ausschließlich in embryonalen Stammzellen (ESC) exprimiert und ist essentiell für den Erhalt der Pluripotenz. Mit zunehmender Differenzierung nimmt die OCT4-Expression ab, parallel dazu nimmt die DNA-Methylierung der regulatorischen Region des OCT4-Gens zu. In der hier vorliegenden Arbeit wurde der DNA-Methylierungsstatus eines ausgewählten Bereichs innerhalb der regulatorischen Region des OCT4-Gens in unrestringierten somatischen Stammzellen (USSC) aus humanem Nabelschnurblut erhoben. Der DNA-Methylierungsstatus wurde mittels genomischer DNA-Sequenzierung nach Bisulfitkonvertierung aus fünf USSC-Linien (SA4/101, SA4/146, SA5/60, SA5/73 und SA8/25) ermittelt und mit differenzierten Zellen (primäre NK-Zellen) sowie ES-Zellen (ES I3) verglichen. Die untersuchte Region innerhalb des regulatorischen Bereichs des OCT4-Gens ist in den fünf untersuchten USSC-Linien signifikant weniger methyliert als in der differenzierten primären NK-Zelle. Im Vergleich zu der Zelllinie ES I3 ist der Bereich in USSC signifikant stärker methyliert. Um herauszufinden, ob der gefundene DNA-Methylierungsstatus in USSC mit der Expression von OCT4 einhergeht, wurde die OCT4-Expression auf mRNA- und Proteinebene mittels quantitativer RT-PCR und Westernblot untersucht. Es konnte keine OCT4-Expression in USSC nachgewiesen werden, weder auf Transkript- noch auf Proteinebene. Auf epigenetischer Ebene ähnelt die USSC hinsichtlich der DNA-Methylierung der untersuchten Region innerhalb des regulatorischen Bereich des Pluripotenzgens OCT4 einer embryonalen Stammzelle. Die fehlende OCT4-Expression entspricht dagegen vielmehr dem Genexpressionsmuster differenzierter Zellen. Im Rahmen der genomischen DNA-Sequenzierung nach Bisulfitkonvertierung wurde in der USSC-Linie SA8/25 eine Punktmutation innerhalb der regulatorischen Region des OCT4-Gens entdeckt, die zu einer Elimination eines CG-Dinukleotids führt. Infolgedessen kann hier keine Methylierung stattfinden. Mittels Promotorreporter-Assay wurde untersucht, ob dadurch die OCT4-Promotoraktivität gesteigert wird. Es zeigte sich, dass die Punktmutation nicht zu einer signifikanten Steigerung der OCT4-Promotoraktivität führt. Offensichtlich scheint eine einzelne fehlende Methylierungsmöglichkeit im regulatorischen Bereich des OCT4-Gens keinen nennenswerten Einfluss auf die OCT4-Promotoraktivität zu nehmen. Die vorliegenen Ergebnisse zeigen erstmals eine interessante Diskrepanz zwischen dem stammzellspezifischen epigenetischen Muster des OCT4-Gens in USSC und der nichtvorhandenen Transkription des Gens. Allerdings wurde in dieser Arbeit nur ein kleiner Teil der regulatorischen Region des OCT4-Gens untersucht, der den OCT4-Minimalpromotor und einen Teil des Exons 1 umfasst. In zukünftigen Arbeiten sollte die Analyse der DNA-Methylierung daher auf die gesamte regulatorische Region des OCT4-Gens ausgeweitet werden, um ein genaueres Bild der epigenetischen Signatur in Zusammenhang mit der fehlenden OCT4-Expression von USSC zu erhalten. Ebenso könnte die gesamte regulatorische OCT4-Region inklusive der Punktmutation in einem Promotorreporter-Assay untersucht werden, um zu klären, ob nicht durch Fehlen der übrigen regulatorischen Elemente (Distaler und Proximaler Verstärker) keine ausreichende Promotoraktivität gemessen wurde.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	07.06.2017
Dateien geändert am:	07.06.2017
Promotionsantrag am:	08.12.2015
Datum der Promotion:	30.05.2017