Dokument: Trafficking of voltage-activated calcium channels

Titel:	Trafficking of voltage-activated calcium channels
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42573
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170710-100636-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Conrad, Rachel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,46 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.06.2017 / geändert 06.06.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Hidalgo, Patricia [Gutachter] Prof. Dr. Klöcker, Nikolaj [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Voltage-activated calcium channels (VACC) are major contributors to the entry of calcium into excitable cells that in turn initiates a variety of cellular functions. In order to coordinate calcium signals and to prevent deleterious intracellular calcium accumulation, permeation through these channels is tightly regulated in time and space. The amount of calcium entering the cell is controlled by its biophysical properties as well as by the number of channels assembled in the plasma membrane. The mechanisms regulating VACCs cell surface expression that is given by the balance between anterograde and retrograde trafficking are poorly understood. VACCs are hetero-multimers formed by an α1 pore-forming subunit (CaVα1) that associates with one or more accessory subunits, including the β-subunit (CaVβ). It is well established that CaVβ is required for CaVα1 exit from the endoplasmic reticulum (ER), and that CaVα1 - CaVβ association at the level of the plasma membrane is reversible though the subunit stoichiometry of the transport is unclear. The aim of this study was to investigate the trafficking pathway of the L-type CaV1.2 channels that are predominantly expressed in cardiac cells and the effect of CaVβ. Further I aimed to analyze the motional dynamics of the channel during its itinerary. I used molecular biology techniques to express fluorescently labelled CaV1.2 and CaVβ in mammalian cells and laser scanning confocal microscopy for live imaging to visualize the channel’s location during its anterograde and retrograde pathway. Single particle tracking was used to estimate the type of motion as well as the dynamic parameters of the channel during its intracellular journey and compares the effect of two isoforms CaVβ2a and CaVβ2b. My results show that CaVβ provides a very efficient release of CaV1.2 from the ER to the Golgi-system independent from microtubules integrity and that the channels, packed into vesicles, are further cotransported with CaVβ along microtubules towards the plasma membrane. The two CaVβ isoforms show different impact on the channels transport dynamics. During its itinerary the channels shows alternating motion combining directed active transport interrupted by periods of confined movement. The channel surface expression is regulated by an actin-dependent endosomal recycling pathway, lysosomal degradation does not contribute. Dissociation of CaVβ at the level of the plasma membrane is the regulatory factor, initiating the internalization and the retrograde transport of CaV1.2 towards recycling endosomes until its reinsertion in the plasma membrane. In summary my work contributes to understand the intracellular transport of voltage-activated calcium channels. Spannungsabhängige Kalziumkanäle (VACC) sind maßgeblich an dem Einfluss von Kalziumionen in erregbare Zellen beteiligt, wodurch eine Vielzahl zellulärer Funktionen gesteuert wird. Um diese Kalziumsignale zu koordinieren und gleichzeitig eine schädliche Akkumulation von Kalzium in der Zelle zu vermeiden, muss die Regulation der Kanäle sowohl zeitlich als auch räumlich sehr präzise kontrolliert werden. Der regulierende Mechanismus für die gleichbleibende Expression von Kanälen an der Zelloberfläche ist die Erhaltung eines Gleichgewichts zwischen nach außen und nach innen gerichtetem Transport innerhalb der Zelle. VACCs bestehen je nach Subtyp aus einer porenbildenden α1-Untereinheit (CaVα1) assoziiert mit einer oder mehreren zusätzlichen Untereinheiten, einschließlich der β-Untereinheit (CaVβ). Es ist bekannt, dass CaVβ für die Freisetzung von CaVα1 aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) notwendig, und dass die Assoziation der beiden Untereinheiten an der Plasmamembran reversibel ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Transportweg des Kanals mit Hinblick auf die regulatorische Funktion von CaVβ zu untersuchen. Außerdem wurden die Bewegungsparameter des Kanals genauer analysiert. Dafür wurden CaV1.2, überwiegend vorkommend in Herzzellen, und CaVβ fluoreszent markiert und deren Lokalisation und Bewegung in lebenden HEK293 Zellen mithilfe von konfokaler Laserscanning-Mikroskopie untersucht. Durch ‚Single particle tracking‘ wurden die Bewegungsvorgänge des Kanals sowie deren dynamische Parameter bestimmt. Ich konnte beobachten, dass CaVβ eine sehr effiziente Freilassung von CaV1.2 aus dem ER und einen schnellen Transport zum Golgi herbeiführt, unabhängig von Tubulin. Vom Golgi aus werden die Kanäle, in Vesikeln, im Kotransport mit CaVβ, durch Motorproteine entlang von Tubulin Filamenten zur Plasmamembran transportiert. Dabei zeigen die beiden Isoformen von CaVβ, 2a und 2b, einen unterschiedlichen Einfluss auf die Transportdynamik von CaV1.2. Entlang der Transportroute zeigt der Kanal alternierende Bewegungsformen von aktivem Transport unterbrochen von Perioden beschränkter Zufallsbewegung. Die Expression der Kanäle in der Membran wird durch einen von F-Aktin abhängigen Recycling Prozess reguliert, es findet kein lysosomaler Abbau statt. Dabei ist CaVβ der regulierende Faktor. Durch Dissoziation von CaV1.2 an der Plasmamembran initiiert CaVβ dessen Internalisierung und den retrograden Transport zum Recycling Endosome und die anschließende Wiedereinfügung in die Plasmamembran. Zusammengefasst, trägt meine Arbeit zum Verständnis des intrazellulären Transport spannungsabhängiger Kalziumkanäle bei.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	10.07.2017
Dateien geändert am:	10.07.2017
Promotionsantrag am:	09.12.2016
Datum der Promotion:	01.06.2017