Dokument: Einflüsse von Insulin, der atypischen Proteinkinase C und Gallensäuren auf die Aktivität der Glucokinase in Ratten- Hepatozyten
| Titel: | Einflüsse von Insulin, der atypischen Proteinkinase C und Gallensäuren auf die Aktivität der Glucokinase in Ratten- Hepatozyten | |||||||
| Weiterer Titel: | Influence of insulin, atypical Proteinkinase C and bile acids on the activity of glucokinase in rat hepatocytes | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42443 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170526-083412-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Lauermann, Christian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Kubitz, Ralf [Gutachter] Prof. Dr. Matthias Schott [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Glucokinase, atypische Proteinkinase C, Gallensäuren | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Proteinkinasen der Gruppe C (PKC) sind wichtige Enzyme intrazellulärer Signalkaskaden und steuern zahlreiche Abläufe in verschiedensten Zellen. Die Proteinkinase C-Isoformen werden in Abhängigkeit ihres Aktivierungssignals in drei Gruppen eingeteilt: klassische PKCs, novel PKCs und atypische PKCs. Die Aktivität der atypischen PKCs (aPKCs) wird u.a durch Bindung des inhibitorischen Pseudosubstrats (PS) negativ reguliert. Um den Einfluss der aPKCs auf die Genexpression verschiedener Proteine in Leberzellen zu untersuchen, wurde in einem Vorversuch zu diesem Projekt das inhibitorische Pseudosubstrat eingesetzt und das Transkriptom mittels eines DNA MicroArrays ausgewertet. Ergebnis dieses Versuchs war (u. a.) eine signifikante Hemmung der Expression der Glucokinase (GK) nach Zugabe des PS. Ziel dieser Arbeit war es den o.g. Effekt durch weitere Methoden zu validieren. Die GK ist ein wichtiges Enzym für die Regulation des Blutglucosespiegels und phosphoryliert Glucose als erster Schritt der Glykogensynthese.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte der im Vorfeld gesehene Effekt des PS auf die Expression der GK nicht validiert werden, während die Steigerung der mRNA-Synthese durch Insulin bestätigt wurde. Neben der Expression wird die Aktivität der GK durch Veränderung der Lokalisation innerhalb der Zellen reguliert. Hohe intrazelluläre Glucose-Konzentrationen bewirken eine Translokation des Enzyms aus dem Zellkern in das Zytoplasma, wohingegen die GK bei niedrigen Glucose-Spiegeln im Zellkern inaktiv durch das Glucokinase-Regulatory-protein (GKRP) gebunden wird. In dieser Arbeit wurde die GK-Translokation mit Hilfe von Immunfluoreszenz-Versuchen und einer neuen Methode zur automatisierten Bildanalyse (Zeta Batch UKD Configuration Manager beta V 1.0) unter dem Einfluss von Insulin und dem PS im Vergleich zu bekannten Effektoren der GK-Translokation (Glucose, Sorbitol oder AICAR) gemessen. Weder Insulin noch das PS zeigten einen signifikanten Einfluss auf die Glucose-induzierte Translokation der GK ins Zytoplasma. Auch Gallensäuren, die über verschiedene Mechanismen mit der Glucosehomeostase interferieren können, hatten keinen signifikanten Effekt auf die Translokation der GK.Proteinkinases C regulate various intracellular signalling mechanisms in different cell types. The activity of the aPKCs ζ is mainly regulated through binding of the inhibitory pseudosubstrate (PS). The effect of PS on the gene expression in liver cells was analysed in a DNA Microarray prior to this work. One result was a significant inhibition of the expression of Glucokinase (GK). GK is an important regulating enzyme in the glucose metabolism and acts as a potent sensor for changes in blood glucose level. Besides the regulation on gene expression, GK activation is influenced by rapid change of intracellular localization. High blood glucose levels enhance the translocation of GK from the nucleus to the cytoplasm. The feasible influence of PS or insulin on the translocation was compared to known effectors like Glucose, Sorbitol or AICAR using immunofluorescence. Several studies showed an important effect of bile acids on the glucose metabolism. This is why the effect of CDCA and GCDC were investigated. Specialized software (“Zeta Batch UKD Configuration Manager beta V 1.0”) was developed for immunofluorescence analysis. First aim was to validate the effect of PS on GK gene expression that was shown in the DNA Microarray with quantitative Realtime-PCR. Quantification was done with the use of ΔΔCT method. The cells were primary isolated from male rat livers and stimulated ± insulin (100nM), ± PS (25µM) for two hours. Further feasible influences on the translocation of GK were to investigate. It is known that aPKCs are able to translocate between the nucleus and the cytoplasm. To illuminate the translocation of GK with immunofluorescence, “Zeta Batch UKD CM beta V 1.0” was established. The quotient between the intensity of GK´ fluorescence in the nucleus (NK) and the cytoplasm (Cyt) (I NK/ ICyt) for each cell was determined. ICyt was measured in a 1µm hem around the nucleus. Cells were stimulated with different glucose concentrations (0g/l, 1g/l to 4,5g/l), ± insulin (100nM), ± PS (25µM), ± Sorbitol (500µM), ± CDCA (50µM), ± GCDC,50µM, ± AICAR (200µM) for two hours. Gene expression of GK in rat liver cells was significantly increased after insulin stimulation. qRT-PCR analysis showed a 10-fold (22,98) increase of GK-mRNA compared to the Housekeeping gene GUS. The PS did not show any significant effect on the mRNA synthesis of GK. The dose dependent translocation of GK due to rising glucose concentration was objectively measured with the Zeta Batch UKD CM beta V 1.0 and confirmed. The stimulation with sorbitol showed an increased translocation of GK, while AICAR caused a decreased translocation. Neither Insulin, PS nor bile acids affected the translocation of GK. The inhibitory effect of PS on GK gene expression was not verified by qRT PCR analysis. Neither insulin, aPKC ζ nor the bile acids showed a significant effect on the translocation of GK. Changes of protein localization in cells are an important and fundamental regulation mechanism. The Zeta Batch software is an efficient tool to analyse changes of protein localization. The self-learning software allows evaluation of a multitude of probes in a short amount of time excluding examiner bios. Microscopic images are chosen and digitally recorded by the examiner. Detection of cells is done by a “foreground-background function”. A representative probe with homogenous distribution of intensity levels is needed to provide a “learning process” for analysis of further images. The data should be statistically evaluated in cumulative histograms. In this way slight changes of protein localization can be visualized by a shift of graph compared to a control condition. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 26.05.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 26.05.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.11.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.05.2017 |
