Dokument: MC4R ligands: Molecular features, membrane interactions and their potential role in modulation of hormone signaling
| Titel: | MC4R ligands: Molecular features, membrane interactions and their potential role in modulation of hormone signaling | ||||||||||||||||
| Weiterer Titel: | MC4R Liganden: Molekulare Eigenschaften, Membraninteraktionen und ihre potentielle Rolle in der Modulierung von Hormon-Signalübertragungen | ||||||||||||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42297 | ||||||||||||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170512-100710-4 | ||||||||||||||||
| Kollektion: | Dissertationen | ||||||||||||||||
| Sprache: | Englisch | ||||||||||||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | ||||||||||||||||
| Medientyp: | Text | ||||||||||||||||
| Autor: | M.Sc. Schriek, Sabine [Autor] | ||||||||||||||||
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| Beitragende: | Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | ||||||||||||||||
| Stichwörter: | MC4R, ACTH, Melanocortins, GPCR | ||||||||||||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | ||||||||||||||||
| Beschreibungen: | Feeling hungry – or saturated? This feeling is predominantly regulated in your brain by a complex interplay between several hormones and the membrane protein melanocortin receptor 4 (MC4R). This membrane protein belongs to the pharmacologically extremely important class of G-protein coupled receptors (GPCRs). So far no experimental high-resolution insights into the structural and dynamical details underlying ligand mediated MC4R activation exist but they could give rise to a new class of GPCR-drugs with improved pharmacology.
In this work we aimed to study the features of the peptide ligands of MC4R free in solution and in presence of synthetic lipid bilayers (nanodiscs) to gain understanding of the hormones’ characteristics in physiological conditions including membrane mimicking environments. Therefore, we established the expression of peptide ligands in E. coli and of MC4R in human embryonic kidney (HEK) 293 suspension cells for further use in nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and ligand binding assays. Furthermore, we were able to produce a fluorophore conjugated peptide ligand that was able to probe hormone-membrane interactions in a fluorescence anisotropy (FA)-based binding assay. Down stream activity of MC4R mediated by recombinant and fluorophore conjugated ligands was successfully tested in a cAMP bioassay. Our NMR data revealed that all recorded ligands are generally unfolded, but ACTH and alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) do show secondary conformations for several amino acids. In addition, we propose a model of a amino-terminal (N-terminal) binding mode of ACTH when interacting with membranes containing negatively charged lipids with strong interactions up to position 14 and weaker binding of the remaining residues. We were able to show that this interaction can be modulated by the addition of calcium, indicating a so far unknown way of hormone signaling modulation. Thus this work does not only represent the basis for future NMR studies of melanocortin-receptor interactions, as well as provide essential information and tools for the optimization of sample preparation, but also suggests that hormone-membrane interactions could play a role in physiological signaling processes.Fühlen Sie sich hungrig - oder satt? Dieses Gefühl wird vorwiegend durch ein komplexes Wechselspiel zwischen verschiedenen Hormonen und dem Membranprotein Melanocortin Rezeptor 4 (MC4R) in Ihrem Gehirn reguliert. Dieses Membranprotein gehört zu der pharmakologisch extrem wichtigen Klasse der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Bisher gibt es keine hochaufgelösten Einblicke in die strukturellen und dynamischen Details, die der Liganden-vermittelten MC4R-Aktivierung zugrunde liegen, diese können jedoch zu einer neuen Klasse von GPCR-Medikamenten mit verbesserter Pharmakologie fuhren. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Eigenschaften der Peptidliganden von MC4R frei in Lösung und in der Gegenwart von synthetischen Lipiddoppelschichten (Nanodiscs) zu studieren, um ein Verständnis der Charakteristika der Hormone unter physiologischen Bedingungen, einschließlich einer Membran nachahmenden Umgebung, zu erhalten. Deshalb wurde die Expression von Peptidliganden in E. coli und von MC4R in HEK 293 Suspensionszellen fur den weiteren Gebrauch in NMR-Experimenten und Liganden-Bindungsassays etabliert. Des Weiteren konnten wir einen Fluorophorkonjugierten Peptidliganden herzustellen, welcher in der Lage war, Hormon-Membran Interaktionen in einem Fluoreszenzanisotropie basierten Bindungsassay zu sondieren. Die ligandenvermittelte "Down Stream" Aktivität von MC4R durch rekombinante und Fluorophor konjugierte Liganden wurde erfolgreich in einem cAMP basierten Bioassay getestet. Unsere NMR-Daten zeigen, dass alle aufgenommenen Liganden generell ungefaltet sind, jedoch zeigen die Hormone ACTH und α-MSH sekundäre Konformationen für mehrere Aminosäuren. Zusätzlich konnten wir ein Modell der Membraninteraktion für ACTH erarbeiten, welches sich durch eine starke Interaktion der N-terminalen Aminosäuren bis zu der Position 14 und eine schwächere Bindung der weiteren Reste mit negativ geladenen Lipiden auszeichnet. Wir konnten ebenfalls zeigen, dass diese Interaktion durch die Zugabe von Calcium moduliert werden kann, was auf einen bisher unbekannten Weg der Hormonsignalmodulierung hindeutet. Deshalb repräsentiert diese Arbeit nicht nur die Basis für zukünftige NMR-Studien von Melanocortin-Rezeptor Interaktionen und liefert essentielle Informationen und Hilfsmittel für die Optimierung der Probenvorbereitung, sondern sie legt auch nahe, dass Hormon-Membran Interaktionen eine Rolle in physiologischen Signalprozessen spielen könnten. | ||||||||||||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | ||||||||||||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | ||||||||||||||||
| Dokument erstellt am: | 12.05.2017 | ||||||||||||||||
| Dateien geändert am: | 12.05.2017 | ||||||||||||||||
| Promotionsantrag am: | 01.03.2017 | ||||||||||||||||
| Datum der Promotion: | 28.03.2017 |
