Dokument: Anwendung und Optimierung des TREX-Systems zur effektiven heterologen Sekundärmetabolit-Produktion in Pseudomonas putida

Titel:	Anwendung und Optimierung des TREX-Systems zur effektiven heterologen Sekundärmetabolit-Produktion in Pseudomonas putida
Weiterer Titel:	Application and optimization of the TREX-system for effective heterologous secondary metabolite production in Pseudomonas putida
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42275
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170515-102302-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Domröse, Andreas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.05.2017 / geändert 04.05.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	Prodigiosin, TREX-System, Sekundärmetabolite, Pseudomonas putida, Gencluster
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Mikroorganismen sind eine nahezu unerschöpfliche Quelle für Sekundärmetabolite. Viele dieser Naturstoffe weisen dabei pharmazeutisch wertvolle Eigenschaften auf und der Bedarf an neuen Pharmazeutika wächst stetig. Da die Kultivierung vieler natürlicher Sekundärmetabolit-Produzenten im Labor nicht oder nur eingeschränkt möglich ist, können solche Naturstoffe häufig nur in wirtsfremden Mikroorganismen effizient produziert werden. Diese heterologe Expression ist jedoch aufgrund der Kodierung der meisten Sekundärmetabolit-Biosynthesewege in sogenannten Genclustern mit verschiedenen Herausforderungen verbunden. So muss z.B. die stabile Etablierung des jeweiligen Genclusters im Expressionswirt sowie eine effektive Expression sämtlicher Gene gewährleistet werden. Das zuvor in der AG Drepper (Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) entwickelte Transfer and Expression- oder kurz TREX-System stellt ein molekularbiologisches tool dar, das dies ermöglichen kann. Bislang konnte gezeigt werden, dass sich das TREX-System grundsätzlich als screening tool eignet, um schnell geeignete Kombinationen von Wirtsorganismen und Biosynthesewegen identifizieren zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das TREX-System erstmals gezielt zur effektiven Metabolitproduktion eingesetzt und die hierfür relevanten Aspekte beleuchtet. Desweiteren wurde das System weiterentwickelt, um eine schnelle Generierung neuer Produktionsstämme zu gewährleisten. Zunächst wurde das TREX-System zur Erzeugung von kompetitiven Produktionsstämmen durch randomisierte chromosomale Gencluster-Integration eingesetzt. Bei diesem Ansatz wurden auf Basis des Expressionswirtes Pseudomonas putida erfolgreich 52 Stämme erzeugt, die das pharmazeutisch wirksame Tripyrrol Prodigiosin mit einer Ausbeute von bis zu 94 mg/L produzieren. Die hohen Produktionsleistungen resultieren dabei daraus, dass das unidirektional angeordnete pig-Gencluster aus Serratia marcescens bei der TREX-basierten zufälligen Tn5-Transposition hinter einen starken nativen Promotor des Wirtes integriert wurde. Mittels PCR und DNA-Sequenzierung konnte nachgewiesen werden, dass bei 96 % dieser Stämme das wirtsfremde Gencluster in einem der sieben rRNA-Operons von P. putida lag. Interessanterweise konnte ein direkter Bezug zwischen dem genauen Insertionsort und der Produktionsleistung identifiziert werden. So bewirkt einerseits die Lokalisation der Zielgene in den verschiedenen rRNA-Operons eine unterschiedlich starke Produktion und anderseits wirkt sich ein kurzer Abstand zum jeweiligen rRNA-Operon-Promotor positiv auf die Produktionsleistung aus. Zur Erzeugung von Prodigiosin-Derivaten wurde auf Grundlage eines effizienten Prodigiosin-Produzenten durch eine Gendeletion ein Stamm erzeugt, der in der Biosynthese der Prodigiosinvorstufe MAP defizient ist. Mit diesem Stamm konnten von Andreas Sebastian Klein (Institut für Bioorganische Chemie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf) erfolgreich Mutasynthese-Experimente zur Erzeugung von Prodigiosin-Derivaten durchgeführt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das yTREX-System erzeugt und am Beispiel des pig-Genclusters evaluiert. Diese Weiterentwicklung des TREX-Systems kombiniert dessen Transfer- und Expressionsfunktion mit der Möglichkeit zur homologen Rekombination in Hefe, welche die Klonierung von großen Genclustern erheblich erleichtert. Des Weiteren schafft die homologe Rekombination vielfältige Möglichkeiten der Manipulation von Gencluster-kodierten Biosynthesewegen. Dadurch ergibt sich ein immenses Potential, neue pharmazeutisch wertvolle Sekundärmetabolite schnell für die heterologe Produktion zugänglich zu machen oder vorhandene zu optimieren. Microorganisms provide an almost inexhaustible source for secondary metabolites. Numerous natural compounds exhibit valuable pharmaceutical properties and the demand for new drugs is growing steadily. Since the cultivation of many natural producers under standard laboratory conditions is limited or even impossible, heterologous expression is often the only possibility to gain access to such natural compounds. However, as most of the secondary metabolite biosynthetic pathways are encoded in so called gene clusters, the heterologous expression is associated with several challenges, since the stable establishment as well as the effective expression of all genes has to be accomplished. The transfer and expression or shortly TREX system, developed in the AG Drepper (Institute of Molecular Enzymtechnolog, Heinrich Heine University Düsseldorf) represents a molecular genetic tool which can enable this. So far, it could be demonstrated that the TREX system is generally suitable to allow a quick identification of appropriate combinations of expression hosts and biosynthetic pathways. In this study, the TREX system was applied for the first time with the aim to generate effective metabolite production strains. In addition, it was further developed towards rapid applicability for production strain generation. First, the TREX system was employed to generate competitive secondary metabolite production strains. Based on the versatile expression host Pseudomonas putida, 52 production strains of the pharmaceutically valuable secondary metabolite prodigiosin were successfully generated, leading to production titers of up to 94 mg/L. By using PCR and DNA sequencing techniques it could be demonstrated that constitutive expression of the unidirectionally organised pig gene cluster from Serratia marcescens was achieved by random TREX based Tn5-transposition behind strong host promoters. Remarkably, in 96 % of these strains the insertion locus was located in one of the seven rRNA operons of P. putida. Here, a correlation between the precise insertion site and the production output could be demonstrated. On the one hand, the localization of the target genes in the different rRNA-operons influences the production level and on the other hand, a short distance to the respective rRNA operon promoter has a positive effect on the production output. To generate new prodigiosin derivatives, one of the prodigiosin production strains generated in this study was subsequently mutated resulting in a strain that is deficient in the biosynthesis of the prodigiosin precursor MAP. This strain could successfully be used by Andreas Sebastian Klein (Institute of Bioorganic Chemistry, Heinrich Heine University Düsseldorf) in mutasynthesis experiments to produce several prodigiosin derivatives. Furthermore, in this study the yTREX system was created and evaluated using the pig gene cluster as an example. This improved TREX system combines gene transfer and expression properties with the possibility to perform homologous recombination in yeast. Beside simplified cloning of large gene clusters, this results in a versatile applicability for the manipulation of biosynthetic pathways encoded by clustered genes. In summary yTREX has an immense potential to produce new pharmaceutically valuable secondary metabolites and derivatives thereof.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	15.05.2017
Dateien geändert am:	15.05.2017
Promotionsantrag am:	27.09.2016
Datum der Promotion:	24.01.2017