Dokument: Enreduktasen in der Asymmetrischen Synthese
| Titel: | Enreduktasen in der Asymmetrischen Synthese | |||||||
| Weiterer Titel: | Ene-Reductases in Asymmetric Synthesis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42084 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170510-092806-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dipl.-Chem. Rüthlein, Elisabeth [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Müller, Thomas J. J. [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | organische Synthese, asymmetrische Synthese, Biokatalyse | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Enreduktasen aus der Old Yellow Enzyme (OYE) Familie [EC 1.6.99.1] reduzieren C-C-Doppelbindungen und generieren dabei bis zu zwei Stereozentren in einem Reaktionsschritt. Der Mechanismus entspricht der formalen anti-Addition von Wasserstoff: ein Hydrid wird vom Flavin-Cofaktor übertragen und ein Proton – meist von einem Tyrosinrest – von der entgegengesetzten Seite. Eine breite Palette von aktivierten Alkenen kann als Substrat dienen, wodurch der Einsatz von OYEs in vielen asymmetrischen Synthesen möglich wird. Eine industriell relevante Anwendung, für die die Nutzbarkeit des OYEs YqjM bereits im analytischen Maßstab gezeigt werden konnte, ist die Synthese des (R)-Roche-Esters. Der Roche-Ester ist ein breit genutzter chiraler Baustein, der zum Beispiel in der Synthese von Naturstoffen, Vitaminen, Duftstoffen und Antibiotika zum Einsatz kommt.
Eine der großen Herausforderungen in der Biokatalyse ist das Vorliegen des Katalysators und somit auch der Katalyseprodukte in nur einer enantiomeren Form. Das leicht zugängliche Enantiomer ist der (R)-Roche-Ester bei Herstellung durch OYE-katalysierte Bioreduktion. Enreduktasen, die in dieser Reaktion (S)-Selektivität zeigen, sind kaum bekannt. Für die Enreduktase YqjM wurden bisher keine Varianten mit inverser Stereopräferenz bezüglich dieses Substrats beschrieben. Um solche Varianten zu finden, wurden drei Aminosäurepositionen (H167, I69, C26) und zugehörige Mutationen identifiziert, die die Substratbindung in der nativen Position lockern und eine neue Bindung in geflippter Orientierung möglich machen könnten. Da der Roche-Ester außerdem mittels YqjM und der meisten anderen Enreduktasen wenig effizient umgesetzt wird, wurde eine kleine Bibliothek von aktiveren Substrat-Derivaten getestet. Die Nutzbarkeit der Produkte als synthetische Bausteine wurde dabei erhalten. In den Testumsätzen aller dieser Substrate mittels der Enzym-Bibliothek aus zwölf rational erstellten YqjM-Varianten wurde eine vollständige Selektivitätsumkehr zum anderen Enantiomer des Roche-Esters sowie zweier Substrat-Derivate gefunden. Durch Nutzung des Wildtyps und der YqjM-Varianten konnten so schließlich der (R)- und (S)-konfigurierte Roche-Ester und verschiedene Derivate in präparativem Maßstab mit moderater bis guter Ausbeute und hoher Enantioselektivität hergestellt werden. Daneben konnten zwei Reaktionswege zur chemoenzymatischen Synthese des breit genutzten chiralen Intermediats 2-Methylbutan-1,3-diol identifiziert werden, die beide eine OYE-katalysierte Reaktion beinhalten. Das eine Protokoll produziert beide Stereozentren in einem einzigen Schritt im Rahmen einer Enzymkaskade aus YqjM WT und ADHLK. Insgesamt kann das syn-(2R, 3S)-Diol somit in nur zwei Stufen erhalten werden. Dies ist die kürzeste Synthese von syn-2-Methylbutan-1,3-diol, die bisher in der Literatur bekannt ist. Das zweite Protokoll macht das C2-Stereozentrum in beiden Konfigurationen mittels der gleichen Enreduktase YqjM WT zugänglich. Hierfür wurde das Substrat strategisch modifiziert. In einem weiteren Projekt konnte eine Enzymkaskade aus YqjM WT und der Laccase aus Agaricus bisporus zur Synthese von bestimmten arylierten Chromanonen etabliert werden. Dies kann durch weitere Optimierung der Enzym-Substrat Kombination zu einem stereospezifischen Zugang zu diesen Verbindungen führen. Substituierte Chromanone zeigen hohe biologische Aktivität. Eine effiziente und stereospezifische chemoenzymatische Synthese ist daher von Interesse.Ene reductases from the Old Yellow Enzyme (OYE) family [EC 1.6.99.1] reduce C-C double bonds generating up to two new stereogenic centres within one reaction step. The mechanism involves a formal anti-addition of hydrogen: A hydride derived from the flavin cofactor and the addition of a proton – usually from a tyrosine – from the opposite face. A broad range of activated alkenes can act as substrates, which enables the use of ene reductases in various asymmetric syntheses. One industrially relevant application that has been shown to be possible in analytical scale using the ene reductase YqjM is the synthesis of the (R)-Roche Ester. The Roche Ester is an extensively used chiral precursor in syntheses of natural products as well as in syntheses of vitamins, fragrance components and antibiotics. A challenge biocatalysis regularly faces is the accessibility of only one enantiomer. The easily accessible Roche Ester is the (R)-enantiomer in OYE-catalysed bioreductions. Ene reductases showing (S)-selectivity in this reaction are rare. For the ene reductase YqjM no variants with inverse stereo-preference for this substrate are known so far. In order to find such variants three amino acid positions (H167, I69, C26) and respective mutations were identified that might loosen substrate binding in the original position and rebind the substrate in flipped orientation. As the Roche-Ester precursor is a rather poor substrate for YqjM and most other ene reductases, a small library of more active derivatives was addressed, maintaining the products´ usefulness as synthetic building blocks. The methyl ketone derivative showed a strong increase in catalytic efficiency compared to the ester. Thus, we added this along with the sterically more demanding ethyl ketone to our screening library. Also substrates with benzyl- or allyl-protected hydroxyl group were screened as increased conversions had been reported. A small library of twelve rational mutant enzymes revealed indeed a complete selectivity change towards the other enantiomer of the Roche Ester and two derivatives. Using wild type or engineered variants of YqjM (R)- and (S)-configured Roche Ester as well as derivatives thereof can be produced in preparative scale, with moderate to good yields and high enantioselectivities. In addition to that, we identified two reaction pathways to synthesize the widely used chiral intermediate 2-methylbutan-1,3-diol, both involving an OYE-catalysed reduction. One protocol produces both stereo centres in one step by an enzyme cascade of YqjM wt and ADHLK starting from the Morita–Baylis–Hillman adduct 3-(hydroxymethyl)but-3-en-2-one. The final product syn-(2R, 3S)-diol could thereby be synthesized in only two steps, making it the shortest synthesis of syn-2-methyl butan-1,3-diol so far reported. The second protocol makes it possible to produce the opposite C-2 stereo centre (2S) by the same OYE, YqjM wt, through strategic modification of the substrate. Furthermore, an enzyme cascade of YqjM wt and the laccase from Agaricus bisporus was established for the synthesis of certain arylated chromanones. This can, by further optimization of the OYE-substrate combination, lead to a stereospecific pathway towards those compounds. Substituted chromanones show high biological activity and a highly efficient and stereospecific chemoenzymatic synthesis would therefore be desirable. | |||||||
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| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.05.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.05.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.10.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.11.2016 |
