Dokument: Establishment of a hiPSC-based in vitro model to study environmental and genetic disturbances of neurodevelopmental processes

Titel:	Establishment of a hiPSC-based in vitro model to study environmental and genetic disturbances of neurodevelopmental processes
Weiterer Titel:	Etablierung eines hiPS-basierten in vitro Modells zur Untersuchung von umwelt- und genetisch-bedingten Störungen neuraler Entwicklungsprozesse
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=42045
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170424-091020-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat. Hofrichter, Maxi [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,27 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.04.2017 / geändert 17.04.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Fritsche, Ellen [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Molekulare Untersuchungen von Störungen der menschlichen Gehirnentwicklung werden derzeit hauptsächlich an Tiermodellen durchgeführt. Durch Speziesunterschiede ist jedoch eine direkte Übertragbarkeit der Resultate auf den Menschen nicht immer gegeben. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPS) stellen eine vielversprechende Alternativmethode zur Patienten-spezifischen Krankheitsmodellierung dar, da sie auf humanen Zellen basieren, sich in quasi alle Zelltypen des Körpers differenzieren können und in unbegrenzter Menge zur Verfügung stehen. Das Cockayne Syndrom B (CSB) ist eine seltene, autosomal-rezessive Krankheit, die durch Mutationen im CSB Gen ausgelöst wird und zu schweren neuralen Entwicklungsstörungen führt. In welcher Weise CSB Mutationen jedoch die Gehirnentwicklung beeinträchtigen, ist bisher nicht bekannt, da es keine geeigneten Tiermodelle zur Untersuchung der Gehirnentwicklung von CSB gibt. CSB-defiziente Mäuse zeigen einen signifikant schwächeren neurologischen Phänotyp als CSB Patienten. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung eines hiPS-basierten in vitro Modells zur Untersuchung der Mechanismen, die den pathophysiologischen Veränderungen von CSB Patienten bei der Gehirnentwicklung zugrunde liegen. Analog zu primären humanen Neurosphären, die eine gut erforschte in vitro Methode zur Untersuchung von Gehirnentwicklungsprozessen wie Proliferation, Migration, neuronale und gliale Differenzierung darstellen, wurden hiPS Zellen in drei-dimensionale Neurosphären differenziert. Dazu wurden zwei verschiedene neurale Induktionsprotokolle miteinander verglichen: Im ersten Protokoll wurden die Zellen mit Hilfe von Noggin induziert (Noggin Protokoll), während für das zweite Protokoll ein spezielles neurales Induktionsmedium mit B27 und N2 Mediumzusätzen (NIM Protokoll) verwendet wurde. Beide Protokolle resultierten in der Differenzierung von hiPS Zellen zu neuralen Nestin+/SOX2+ Progenitorzellen. Vergleichende Analysen mit primären humanen Neurosphären zeigten jedoch, dass hiPS-Neurosphären aus dem NIM Protokoll hinsichtlich der Proliferation und Differenzierung den primären Zellen stärker ähnelten als die hiPS-Neurosphären aus dem Noggin Protokoll. Mit Hilfe des NIM Protokolls wurden anschließend hiPS Zellen von zwei verschiedenen CSB Patienten mit zwei verschiedenen Mutationen (p.0 und pArg683x) und zwei gesunden Kontrollen zu Neurosphären differenziert. CSB-defiziente hiPS-Neurosphären zeigten eine veränderte Proliferation über eine Zeitspanne von 14 Tagen. Außerdem konnte eine verringerte Migration und eine Beeinträchtigung der Differenzierung im Vergleich zu den gesunden Kontrollen gemessen werden. Zusammengefasst scheint diese hiPS-basierte in vitro Methode die Untersuchung von Prozessen der Gehirnentwicklung zu erlauben, die zu neuropathologischen Veränderungen bei CSB Patienten führen. Weiterführende Untersuchungen werden die den funktionellen Defekten zu Grunde liegenden Signalwege aufdecken. Studying mechanisms causing human brain disorders remains to be challenging due to the difficulty in obtaining neural tissue from patients. Despite the availability of an enormous variety of transgenic animals, these do not necessarily reflect human disease. Thus, the novel technique of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represents a promising alternative method for patient-specific disease modeling. Cockayne syndrome B (CSB) is a rare autosomal recessive disease caused by mutations in the CSB gene, leading to severe neurodevelopmental defects. How CSB mutations impair brain development is so far enigmatic due to a lack of models to investigate CSB because compared to humans CSB-deficient animal models reveal a significantly milder neurological phenotype. Therefore, the goal of this study was to create a hiPSC-derived in vitro method that allows investigations on the neurodevelopmental pathophysiological mechanisms underlying the severe neurological symptoms of CSB patients. In analogy to primary human neurospheres, which represent a well-studied in vitro method for studying basic processes of brain development, like proliferation, migration, neuronal and glial differentiation, hiPSCs were differentiated into three-dimensional neurospheres. Therefore, two different protocols were compared: one neural induction protocol using noggin (Noggin protocol) and one cultivating cells in neural induction medium containing B27 and N2 medium supplements (NIM protocol). Flow cytometry analyses revealed that both methods resulted in the differentiation of hiPSCs to Nestin+/SOX2+ neural progenitor cells (NPC), forming neurospheres. To test their performance, both hiPSC-derived neurospheres were compared to primary neurospheres generated directly from fetal brains. The comparative studies revealed that with regard to NPC proliferation and neuronal differentiation hiPSC-derived neurospheres created with the NIM protocol are more similar to primary human neurospheres than hiPSC-derived neurospheres generated with the Noggin protocol. Using the NIM protocol, hiPSCs derived from two different CSB patients with two different mutations (p.0 and pArg683x) and two healthy controls were differentiated into neurospheres. CSB-deficient hiPSC-derived neuropsheres display impaired proliferation as measured by the increase of sphere diameter over a time period of 14 days. Moreover, they show a decreased migration capacity and impaired differentiation compared to healthy controls. In summary, this hiPSC-based neurosphere method allows investigations of mechanisms causing human neurodevelopmental disease. Thus, it can be used for studying the pathophysiological mechanisms underlying the neurodevelopmental phenotypes of CSB patients in the future.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Neurobiologie
Dokument erstellt am:	24.04.2017
Dateien geändert am:	24.04.2017
Promotionsantrag am:	18.01.2016
Datum der Promotion:	29.06.2016