Dokument: Investigation of amyloid beta peptide aggregation by small angle neutron scattering and complementary methods

Titel:	Investigation of amyloid beta peptide aggregation by small angle neutron scattering and complementary methods
Weiterer Titel:	Untersuchung der Aβ-Protein-Aggregation mit Kleinwinkelneutronenstreuung und komplementären Methoden
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41788
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170420-100803-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Zhang-Haagen, Bo [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,28 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.04.2017 / geändert 03.04.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Aβ-Protein-Aggregation, Kleinwinkelneutronenstreuung
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, für SANS-Messungen geeignete stabile Aβ-Monomere bei deutlich erhöhten Proteinkonzentrationen (Aβ1-40: 5.4 mg/ml, Aβ1-42: 2.4 mg/ml) in unpolarem Lösungsmittel (100% d-HFIP) zu erhalten89. Die Gyrationsradien wurden mit 1.6 ± 0.1 nm für Aβ1-42 und 1.0 ± 0.1 nm für Aβ1-40, bestimmt, welche beide mit den aus PDB-Strukturen errechneten Radien gut übereinstimmen. Aufgrund der großen Fehlerbalken im hohen Streuungsvektorbereich waren die hochauflösenden Monomer-Strukturen nur schwer ermittelbar. Zusätzlich wurden mithilfe von DLS die hydrodynamischen Radien der Monomere mit 3.2 nm für Aβ1-42 and 1.8 nm für Aβ1-40 bestimmt. Zudem konnte eine Ausscheidung der vorgeformten Aggregate in d-HFIP mit einer Größe von einigen Mikrometern und einem Volumenanteil von <1% als dominierender Prozess ermittelt werden. Allerdings war weder die Fragmentierung noch die Abspaltung von Aggregaten zu beobachten. In wäßriger Pufferlösung bei pH 7,4 ließen sich erfolgreich Proben mit mehr als 90 % Monomeren bei einer niedrigen Inkubationstemperatur (7°C) herstellen, welche mit einer Aβ1-42 Konzentration zwischen 0,1 mg/ml und 1 mg/ml geeignet für zeitaufgelöste SANS- und DLS-Experimente waren. Der unter Verwendung des Beaucage-Models ermittelte Rg der Aβ1-42-Monomere beträgt etwa 1 nm. Zusätzlich wurden kleine Oligomere, die sich aus 5 bis 20 Monomereinheiten zusammensetzten, während des Aggregationsprozesses beobachtet. Bei 0,25 mg/ml Aβ1-42 ließen sich während der gesamten Inkubationszeit Aβ 5-/6-mere mit Rg≈2 nm beobachten. Aufgrund der ähnlichen Größe der Aβ 5- und 6-mere konnten diese nicht voneinander unterschieden werden. Oberhalb und unterhalb von 0,25 mg/ml Aβ1-42 traten zusätzlich zum 5-/6-mer 10-/12-mere und 15-/ 18-mere auf. Dieses Phänomen entspricht deutlich dem Paranuclei-Protofibril-Fibril-Mechanismus mit Aβ 5-/6-mer als Paranukleus, bzw. Baustein, der den Keim zur Aggregation in größere Oligomere und Protofibrillen, sowie Fibrillen darstellt. Mithilfe von SANS sind Paranuklei während des Aggregationsprozesses niemals zuvor beobachtet worden. Die Tatsache, dass 10-/12-mere und 15-/18-mere ganzzahlige Vielfache der 5-/6-mere sind, deutet darauf hin, dass Aggregatwachstum nicht nur durch Monomeraddition sondern auch durch Zusammenlagerung der Paranuklei erfolgen kann. Alternativ könnte es sich auch um ‘off-pathway’-Oligomere handeln, welche als Quelle für in verschiedenen Aggregationsmodellen postulierte 5-/6-mere dienen. Unter Verwendung einer Kombination von Streuungsmethoden (SANS, DLS) mit AFM und AUC konnte ein quantitatives Bild der Aβ-Aggregation erstellt werden. Prinzipiell konnte gezeigt werden, dass SANS sich auf das schwierige System des stark aggregierende Aβ anwenden lässt, wenn Probenvorbereitung und Lösungsbedingungen so optimiert sind, dass ausreichende Peptidkonzentrationen erreicht werden. Damit eröffnet sich eine Vielzahl neuer Möglichkeiten, um die Aggregation von Aβ sowie die damit verbundenen Strukturen von Intermediaten zu erforschen und neue Informationen zu erhalten, die durch andere Methoden nicht zugänglich sind. We were able to characterize stable Aβ monomers for the first time by small angle neutron scattering (SANS) under non-polar conditions (100 % d-HFIP) at extremely high protein concentrations (Aβ1-40: 5.4 mg/ml, Aβ1-42: 2.4 mg/ml)89. The radii of gyration (Rg) were determined to be 1.6 ± 0.1 nm for Aβ1-42 and 1.0 ± 0.1 nm for Aβ1-40, which are in good agreement with the averaged radii from the PDB structures of solid state NMR studies. Further structural details could not be resolved probably due to large structural heterogeneity of the monomeric Abeta peptides leading to large error bars at high scattering vector Q. In a complementary approach, the hydrodynamic radius of monomeric Aβ was obtained from dynamic light scattering (DLS) as 3.2 nm for Aβ1-42 and 1.8 nm for Aβ1-4089. Additionally, the precipitation of preformed aggregates in d-HFIP with sizes of several micrometers and <1% volume fraction as dominating process was observed by time resolved DLS. An obvious change of scattering intensity of monomer was not observed, which indicates neither fragmentation nor dissociation of the preformed aggregates occur in detectable amount. At pH=7.4 in aqueous buffer we successfully prepared the samples with more than 90% monomers at a concentration range between 0.1 mg/ml and 1 mg/ml for time resolved SANS and DLS experiments in an incubation time gap between 0.5 h and 300 h. According to the Beaucage model the Rg of Aβ1-42 monomer is about 1 nm. By SANS small oligomers built from 5 to 20 monomeric units were observed during the aggregation processes. At 0.25 mg/ml we detected a constant low fraction of Aβ42 5- or 6-mer with Rg≈2 nm throughout the whole incubation time. Due to the not sufficiently deviating radii of gyration the 5- and 6-mer could not be distinguished from each other. At Aβ concentrations below and above 0.25 mg/ml a dissociation of 10-/12-mer (or 15-/18-mer) to 5-/6-mer was observed. This phenomenon corresponds roughly to the paranuclei–protofibril–fibril mechanism with Aβ 5-/6-mer as paranuclei and the building unit, which self-assembles to large oligomers and protofibril/fibril. Such small oligomeric Aβ aggregates, which appear to resemble paranuclei, have been detected by SANS never before. The also observed multiples of 5-/6-mers (10-/12-mer, 15-/18-mer) with a globular shape could be ´off-pathway´ oligomers which act as a source for 5-/6-mers as postulated for several aggregation models. Using the combination of scattering methods (SANS, DLS), AFM and AUC a quantitative picture of Aβ aggregation was generated. In particular for SANS it was shown that it is a promising tool for the investigation of the self-assembly pathway of Aβ and other amyloid proteins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	20.04.2017
Dateien geändert am:	20.04.2017
Promotionsantrag am:	26.10.2016
Datum der Promotion:	20.12.2016