Dokument: Single amino acid substitutions in lipase A affect its production and secretion by Bacillus subtilis

Titel:	Single amino acid substitutions in lipase A affect its production and secretion by Bacillus subtilis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41381
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170308-095429-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Skoczinski, Pia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,33 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.03.2017 / geändert 02.03.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Bacillus subtilis als “microbial cell factory” für die Produktion und Sekretion großer Proteinmengen ist auch weiterhin Gegenstand andauernder und neuartiger Optimierungsprozesse und -strategien für die industrielle Anwendung. Solche Strategien zielten bisher auf die Optimierung jedes einzelnen Schrittes der Proteinbiosynthese in B. subtilis ab; also Transkription, Translation, Sekretion, Reifung und Faltung sowie Proteolyse des Proteins im Kulturüberstand. Die Optimierung dieser limitierenden Prozesse erhöhte zwar die Proteinausbeute für sekretierte, homologe Proteine auf bis zu 20 g/l, allerdings stellt die Produktion rekombinanter Proteine in B. subtilis weiterhin ein großes Problem dar, da auch die Gen- und Proteinsequenz des Zielproteins selbst offensichtlich dessen Produktion und Sekretion beeinflusst. Die vorliegende Arbeit kombiniert die erste systematische, Mutagenese-basierte Analyse einzelner Aminosäure- und Codonsubstitutionen mit einer anschließenden, detaillierten Charakterisierung ihrer Effekte auf die Transkription, Aktivität und Proteinmenge. Aufbauend auf diesen experimentellen Daten konnten weitere Varianten mit Hilfe des „rationalen Designs“ generiert werden, bei denen Effekte vorteilhafter Substitutionen kombiniert und übertragen werden. Ziel der durchgeführten Sättigungsmutagenese war die bereits gut charakterisierte Lipase LipA aus B. subtilis, die bereits in vielen anderen Studien als Modelprotein für das “protein engineering“ industriell relevanter Enzyme eingesetzt wurde. Die dafür erzeugte LipA-Bibliothek mit etwa 30.000 Klonen wurde im Hinblick auf die qualitative und quantitative Bestimmung der Lipaseproduktion und -sekretion durch B. subtilis mit einer TECAN® Robotersystem-unterstützten Methode durchmustert, die im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Die anschließende Charakterisierung zeigte für 38 LipA-Varianten eine mindestens zweifach erhöhte extrazelluläre Proteinmenge oder enzymatische Aktivität und ermöglicht damit Erklärungsansätze, wie einzelne Aminosäure- oder Codonsubstitutionen die Proteinproduktion auf verschiedenen Ebenen positiv beeinflussen können; diese sind 1) die lipA-Genexpression, 2) die extrazelluläre spezifische Enzymaktivität sowie 3) die extrazelluläre Proteinmenge der Lipase LipA. Weiterhin wurden mit Hilfe des „rationalen Designs“ sechs vorteilhafte Aminosäuresubstitutionen ausgesucht, welche für die Lipase LipA kombiniert, aber auch auf die paraloge Lipase LipB übertragen wurden. Auf diese Weise konnte die extrazelluläre Proteinmenge einer LipA-Variante weiter, insgesamt vierfach, erhöht werden und auch eine Übertragung auf LipB zeigte in einigen, aber nicht in allen Fällen den erwarteten Effekt. Damit liefern die Ergebnisse der hier durchgeführten systematischen Analyse und Charakterisierung einen umfassenden, detaillierten Einblick in die Zielprotein-Abhängigkeit für die erfolgreiche Proteinproduktion sogar in etablierten Wirtsorganismen. Somit bietet die vorliegende Arbeit zum einen neue Ansatzpunkte für das rationale “protein engineering“ und eine Optimierung der Proteinproduktion in B. subtilis, zum anderen zeigt sie aber auch die Grenzen solcher Methoden auf. Optimization of Bacillus subtilis as a `microbial cell factory` for high level secretory protein production in industrial applications is still an ongoing process with permanently upcoming new strategies. These strategies address to improve every step in the B. subtilis protein production pipeline: transcription, translation, secretion, maturation and folding and proteolysis in the culture supernatant. Although optimization of these bottlenecks increases B. subtilis secretory protein production to 20 g/l for homologous proteins, the successful production of recombinant proteins is still a major drawback. Obviously, also the target protein itself and even its codon composition can influence its production and secretion. This study combines the first systematic mutational analysis for single amino acid and codon substitutions beneficial for protein production with a subsequent detailed characterization of substitution dependent effects on transcription, activity and protein amount. This allows the application of an experimentally generated rational protein design for the combination and transfer of selected beneficial single amino acid substitutions and their effects. For this purpose the well-known homologous lipase A (LipA) from B. subtilis popular used as a model protein for engineering of industrial relevant enzymes was subjected to site saturation mutagenesis. The generated 30,000 LipA clones were investigated with a TECAN® robot screening system, specifically developed for this application for both qualitative and quantitative determination of extracellular LipA production in B. subtilis. Subsequent characterization revealed 38 LipA variants with at least 2-fold increase in extracellular amount or activity and allowed a detailed insight in how different single amino acid or codon substitution can positively affect protein production on the level of 1) lipA gene expression, 2) extracellular LipA specific activity, or 3) amount of extracellular LipA protein. Furthermore, rational combinations of six beneficial amino acid substitutions within LipA and their transfer to the paralogous LipB protein of B. subtilis revealed that increasing extracellular LipA amount 4-fold and also a transfer to LipB with a similar effect is possible in some, but not all cases. In conclusion, the results from this systematic analysis and characterization provide a global, deep view on the dependency of a successful `microbial cell factory` on the target protein, this way providing new starting points for rational protein engineering and efficient protein production in B. subtilis and simultaneously showing the limits of those approaches.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	08.03.2017
Dateien geändert am:	08.03.2017
Promotionsantrag am:	23.08.2016
Datum der Promotion:	07.11.2016