Dokument: Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung von Endothelzellen aus der Mausaorta

Titel:	Isolierung, Charakterisierung und Kultivierung von Endothelzellen aus der Mausaorta
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41366
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170307-113808-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Saraldi, Meral [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,91 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.03.2017 / geändert 02.03.2017
Beitragende:	Prof. Dr. med. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Elvers, Margitta [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Makrovaskuläre arterielle Endothelzellen spielen bei der Entstehung einer Arteriosklerose eine zentrale Rolle. Für detaillierte Studien der zugrunde liegenden pathophysiologischen Vorgänge sind daher in-vitro-Modelle aus gut definierten makrovaskulären arteriellen Endothelzellen erforderlich. Es wurden bereits diverse Methoden zur Isolierung dieser Endothelzellen aus verschiedenen Spezies beschrieben. In Hinblick auf Effizienz und Reproduzierbarkeit waren diese jedoch unzureichend. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung einer einfachen und reproduzierbaren Methode zur Gewinnung und Kultivierung arterieller makrovaskulärer Endothelzellen aus der Aorta der Maus für in-vitro-Studien. Die Maus wurde als Quelle für makrovaskuläre arterielle Endothelzellen wegen der Verfügbarkeit von transgenen Tiermodellen gewählt. Zu diesem Zweck wurden Aorten 28-35 Tage alter Mäuse, die vom Aortenbogen bis zur Iliakalbifurkation in voller Länge entnommenen wurden, längs aufgetrennt und in einem Enzymgemisch inkubiert. Die sich demarkierende Endothelschicht wurde mit dem Ziel einer hohen Endothelzellausbeute sowie minimaler Kontamination durch nicht-endotheliale Zellen vorsichtig mit einem Plastikschaber abgetragen. Nach kurzzeitiger Kultivierung wurde die Zellausbeute aus ca. 16 Aorten gepoolt. Aus dieser primären Mischkultur wurden die Endothelzellen durch magnetische Zellseparation mit von Invitrogen speziell für diese Arbeit zur Verfügung gestellten, CD31-gekoppelten Dynabeads isoliert und erneut in Kultur genommen. Die Reinheit der Endothelzellkulturen wurde zu verschiedenen Kulturzeitpunkten durch den Nachweis der Endothelzellmarker PECAM-1/CD31, ICAM-2/CD102, CD73, ICAM-1/CD54, VCAM-1/CD106, Endoglin/CD105 sowie des von-Willebrand-Faktors (vWF) und der Dil-Ac-LDL-Aufnahme mittels FACS-Analysen und Immunzytochemie bestimmt. Nach diesem Vorgehen wurden insgesamt 6 breit angelegte Experimente durchgeführt. Im Laufe der Experimente wurden entsprechend der bereits gewonnenen Erkenntnisse und der Anforderungen an die Methode optimierende Modifikationen am Protokoll vorgenommen. Die Auswertung aller Experimente ergab, dass mit der von uns gewählten Methode Endothelzellen erfolgreich aus der Mausaorta isoliert werden können. Nach der magnetischen Zellseparation hatten die Kulturen einen sehr hohen Endothelzellanteil. Allerdings wurden auch wesentliche Nachteile der Methode deutlich: die Ausbeute an Endothelzellen aus den Mausaorten war generell gering. Zudem gab es Hinweise auf eine Dedifferenzierung der Endothelzellen mit Verlust des endothelialen Phänotyps. Bei reinen Endothelzellkulturen mit erhaltenem endothelialen Phänotyp wurde ein sehr langsames Proliferationsverhalten beobachtet, wohingegen dedifferenzierende Endothelzellen deutlich schneller proliferierten. Als mögliche Störfaktoren müssen angesehen werden: die mechanische Behandlung der Aorten, Trypsin als Serinprotease könnte die Aussagekraft von CD31 eingeschränkt haben und Dynabeads könnten einen toxischen Effekt ausgeübt haben. Es wird diskutiert, dass eine weitere Verbesserung des Protokolls in der Verwendung von neonatalen Mäusen, der Zellaufreinigung mit der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung oder der Immortalisierung muriner Aortenendothelzellen bestehen könnte.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	07.03.2017
Dateien geändert am:	07.03.2017
Promotionsantrag am:	29.07.2016
Datum der Promotion:	08.02.2017