Dokument: Biochemische und Biophysikalische Charakterisierung des Adhäsins und Invasins Pmp21 von Chlamydia pneumoniae
| Titel: | Biochemische und Biophysikalische Charakterisierung des Adhäsins und Invasins Pmp21 von Chlamydia pneumoniae | |||||||
| Weiterer Titel: | Biochemical and Biophysical Characterization of the Adhesin and Invasin Pmp21 from Chlamydia pneumoniae | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41305 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170301-085905-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Luczak, Sören [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Chlamydien sind obligat intrazelluläre Pathogene und lösen in Menschen vielfältige Krankheiten aus. Die Adhäsion des infektiösen Elementarkörperchens an die Wirtszelle ist ein entscheidender Schritt in der chlamydialen Pathogenese. Wichtig für die Adhäsion sind die Mitglieder der Polymorphen Membranproteine (polymorphic membrane proteins; Pmp), die in Chlamydia pneumoniae (C.pn.) 21 Mitglieder und in Chlamydia trachomatis 9 Mitglieder umfassen. Pmp21 aus C. pn. bindet an den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (epidermal growth factor receptor; EGFR). Pmps zeichnen sich in ihrer zentralen Passagierdomäne (PD) durch zahlreiche FxxN und GGA (I, L, V) Tetrapeptidmotive aus. Für bestimmte Pmp21 Domänen ist bekannt, dass die Anwesenheit mindestens zwei dieser Motive entscheidend für die Adhäsion ist.
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass mehrere Abschnitte der Pmp21 PD, sowie PmpA und PmpC aus Chlamydia trachomatis, längliche Oligomere mit einer protofibrillären Form ausbilden. Des Weiteren konnte für das FxxN Motiv in Pmp21-D (D-Wt), eine Domäne von Pmp21, beschrieben werden, dass es die Selbstinteraktion, Faltung und adhäsiven Eigenschaften beeinflusst. Renaturiertes D-Wt bildet neben Monomeren (1,6 S) Oligomere (D-Wt-O) mit großen Sedimentationskoeffizienten (8-85 S) aus. Die Oligomere besitzen die Form von länglichen amyloiden Protofibrillen. Mittels der Amyloid-spezifischen Farbstoffe Thioflavin-T (ThT) und Kongorot (CR) konnte für die Oligomere von D-Wt eine ThT-Fluoreszenz und eine CR-Absorption vergleichbar mit der des humanen amyloiden Proteins β42 nachgewiesen werden. Außerdem besitzen die Oligomere eine mit amyloiden Proteinen vergleichbare hohe Temperaturstabilität. Eine mutierte Version von Pmp21-D (D-Mt), bei dem die FxxN Motive durch SxxV ersetzt wurden, zeigte eine deutliche Reduzierung der Oligomerbildung (D-Mt-O). Sekundärstrukturanalysen zeigten, dass die Monomere von D-Wt und D-Mt überwiegend als zufällig gewunden (random coils) vorliegen, während die Oligomere überwiegend β-Faltblätter (β-sheets) ausbilden. In Adhäsionsstudien wurde gezeigt, dass die Oligomere von D-Wt eine signifikant erhöhte Bindung an humane Epithelzellen im Vergleich zu D-Mt-O und monomeren Proteinspezies besitzen. Mit Hilfe eines Rezeptor-pulldowns konnte gezeigt werden, dass der EGFR von D-Wt-O ca. doppelt so effektiv gebunden werden konnte wie von D-Wt-M. Bedeutenderweise kann durch eine Vorbehandlung der Humanzellen mit D-Wt-O, im Gegensatz zu allen anderen Proteinspezies, die Infektion einer C. pneumoniae Infektion signifikant verringert werden. Folglich induziert das FxxN Motiv in D-Wt die Ausbildung von β-sheet-reichen, oligomeren Protofibrillen, die wichtig für die Adhäsion und Infektion der humanen Zelle sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die C-Pmp21 genannte C-terminale Region von Pmp21 untersucht. Pmps werden aufgrund bioinformatischer Analysen häufig als Typ V Autotransporter bezeichnet. Jedoch fehlt hierfür der experimentelle Nachweis. Durch die Expression von rekombinantem C-Pmp21 in Escherichia coli konnte gezeigt werden, dass C-Pmp21 in die äußere Membran eingebaut und selbständig auf der Zelloberfläche präsentiert wird. Zusätzlich konnte ein Detergenz identifiziert werden, mit dem C-Pmp21 aus der Membran solubilisiert werden konnte. Anhand der durch die Solubilisierung ermöglichten Sekundärstrukturanalyse wurde festgestellt, dass das Protein reich an β-sheets ist. Des Weiteren wurden initiale Kristallisationsscreens gestartet, um den Grundstein für die Analyse der Tertiärstruktur mittels Röntgenkristallographie zu legen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob der N-terminale Bereich von C-Pmp21 ein sogenanntes Autochaperon enthält. Einige Typ Va Autotransporter besitzen Autochaperone, die die Faltung der PD sozusagen durch Ausbildung einer Schablone, anhand derer die restliche PD gefaltet wird, initiieren. In dieser Arbeit konnte jedoch kein Hinweis darauf gefunden werden, dass Pmp21 ein Autochaperon enthält. Da die FxxN Motive im ersten Teil dieser Arbeit als Ursprung für die Selbstfaltung und -assemblierung von M-Pmp21 und D-Wt identifiziert werden konnten, deutet somit alles darauf hin, dass zumindest für Pmp21 kein Autochaperon benötigt wird. Gleichzeitig weist es auf die besondere Bedeutung der FxxN Motive für die Funktion und Faltung der Pmps hin.Chlamydiae sp. are obligate intracellular pathogens that cause a variety of diseases in humans. Adhesion of Chlamydiae to the eukaryotic host cell is a pivotal step in pathogenesis. The adhesin family of polymorphic membrane proteins (Pmp) in Chlamydia pneumoniae consists of 21 and in Chlamydia trachomatis of 9 members. Pmp21 binds to the epidermal growth factor receptor (EGFR). Pmps contain large numbers of FxxN and GGA (I, L, V) motifs. At least two of these motifs are crucial for adhesion by certain Pmp21 fragments. In the first part of this thesis it was found that several domains of the Pmp21 passenger domain (PD) as well as PmpA and PmpC from Chlamydia trachomatis serovar E can form elongated oligomers with a protofibrilar shape. Furthermore we describe how the two FxxN motifs in Pmp21-D (D-Wt), a domain of Pmp21, influence its self-interaction, folding and adhesive capacities. Refolded D-Wt molecules form monomers (D-Wt-M) with 1.6 S as well as oligomers (D-Wt-O) with high sedimentation values (8 to 85 S). These oligomers form elongated protofibrils. Analysis of D-Wt-O with the amyloid specific dyes Thioflavin-T (ThT) and Congo red (CR) showed a ThT-fluorescence as well as a CR absorption comparable to the human amyloid protein fragment β42. Furthermore the oligomers have a high temperature stability comparable to other amyloidic proteins. A mutant version of Pmp21-D (D-Mt), with FxxN motifs replaced by SxxV, shows a markedly reduced capacity to form oligomers (D-Mt-O). Secondary-structure assays revealed that monomers of both variants exist predominantly as random coils, whereas the oligomers form predominantly β-sheets. Adhesion studies revealed that oligomers of D-Wt mediated significantly enhanced binding to human epithelial cells relative to D-Mt-O and monomeric protein species. Additionally, receptor pulldown revealed that the EGFR was bound as twice as effective by the oligomers as by D-Wt-M. Importantly, pre-treatment of human cells with D-Wt-O reduces infectivity upon subsequent challenge with C. pneumoniae more effectively than all other protein species. Hence, the FxxN motif in D-Wt induces the formation of β-sheet-rich oligomeric protofibrils which are important for adhesion to, and subsequent infection of, human cells. In the second part of this thesis the C-terminal region of Pmp21 termed C-Pmp21 was analyzed. Pmps are often referred to the Type Va autotransporters because of bioinformatical predictions. However, experimental evidence is missing. By expression of C-Pmp21 in Escherichia coli we found C-Pmp21 incorporated into the outer membrane as well as a cell surface presented. Additionally we found a detergent sufficient for solubilization of C-Pmp21 out of the E. coli membrane. With the solubilized protein we performed secondary structure analysis and found it rich in β-sheets. This protein was used in initial crystallization screens with the aim to elucidate the tertiary structure by X-ray. In the third part of this thesis it was analyzed if the N-terminal region of C-Pmp21 harbors an autochaperone. Autochaperones are present in some Type Va autotransporters and induce the folding of the PD by formation of the initial folding of the PD. However, the experiments revealed no evidence for an autochaperone function. Because in the first part of this thesis the FxxN motives in M-Pmp21 and D-Wt were identified as being relevant for folding and assembly of Pmp oligomers, it seems that no autochaperone is needed in Pmp21. Simultaneously these findings show the overwhelming importance of the FxxN Motives in terms of function and folding of the Pmps. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 01.03.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 01.03.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.12.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 27.01.2017 |
