Dokument: Expression of biopharmaceuticals in Ustilago maydis

Titel:	Expression of biopharmaceuticals in Ustilago maydis
Weiterer Titel:	Expression von Biopharmazeutika in Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41004
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170126-093040-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Terfrüchte, Marius [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,55 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.01.2017 / geändert 25.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	To satisfy the rapidly increasing biopharmaceutical market, a broad variety of microbial protein expression systems is requested by the industry. High demands are made on safety, variability, feasibility and production yields. One alternative system is based on unconventional secretion in Ustilago maydis and enables secretory expression of large unglycosylated proteins of pro- and eukaryotic origin. To prove the potential of the system in the production of pharmaceutically relevant proteins, various antibody fragments were expressed. Severe yield losses due to the high proteolytic potential of the fungus were tackled by deletion of secreted proteases and the application of strong promoters could increase the expression rate. Nevertheless, yield and stability of unconventionally secreted proteins were not satisfying. Hence, the optimization of the expression system on multiple levels was subject of this study. To determine an optimal expression construct design, a set of nanobody variants against the fluorescence reporter protein Gfp was used. The investigations yielded constructs for optimized stability and purification. Expression of nanobodies in fusion with the horseradish peroxidase demonstrated functionalization and simplified detection, but led to interferences with nanobody activity in the supernatant. Expression and unconventional secretion of a nanobody antitoxin directed against Botulinum neurotoxin A could furthermore prove the flexibility and applicability of the expression constructs. Moreover, the potential malaria antigen PfRh5 was successfully secreted by this pathway. Yet application of the different optimization steps did not allow efficient purification of the potential vaccine candidate, indicating that each target needs carefully designed individual construct modifications. A very important factor for the establishment of an expression platform is to consider the cultivation parameters and cell physiology. These parameters strongly influence the effectivity of the expressing organism and play a crucial role in product yield and stability. RAMOS cultivations for online monitoring of the organisms condition during cultivation in combination with detailed offline analyses of crucial parameters revealed a link between culture broth acidification and proteolytic degradation of the product. The use of protease deficient expression strains combined with tight pH control and optimized nutrient availability thus led to a substantial increase of product yield. Quantifications revealed a maximum yield of at least 420 µg/L unconventionally secreted protein, representing a 14-fold increase compared to previous studies. Overall, considerable improvements in product yield, product stability, downstream processing and applicability could be achieved and critical factors that need further improvement could be identified. Hence insights obtained in this study essentially contribute to the steady advancement of the U. maydis expression system towards an industrially used expression platform for biopharmaceuticals. Um den rasch wachsenden Markt für biopharmazeutische Produkte zu bedienen, wird eine Vielzahl mikrobieller Expressionssysteme benötigt. An diese werden besonders hohe Ansprüche in den Bereichen Sicherheit, Variabilität, Ausbeute und Wirtschaftlichkeit gestellt. Ein alternatives System basiert auf unkonventioneller Sekretion in Ustilago maydis und ermöglicht die sekretorische Expression großer, unglykosylierter Proteine sowohl eu- als auch prokaryotischen Ursprungs. Um die Anwendung des Systems für die Expression pharmazeutisch relevanter Proteine zu untersuchen, wurden bereits verschiedene Antikörperfragmente produziert. Zur Verringerung von Verlusten aufgrund des hohen proteolytischen Potentials des Pilzes wurden sekretierte Proteasen deletiert. Weiterhin konnte durch den Einsatz starker Promotoren das generelle Expressionslevel gesteigert werden. Trotz aller Erfolge und Verbesserungen waren Ausbeute und Stabilität der unkonventionell sekretierten Produkte unbefriedigend. Aus diesem Grund wurde in dieser Untersuchung der Fokus auf die weitere Optimierung des Expressionssystems gelegt. Zur Identifizierung geeigneter Expressionskonstrukte wurde eine Reihe unterschiedlicher Nanobody Varianten gegen das Fluoreszenzprotein Gfp hergestellt. Hierbei konnten Konstrukte zur verbesserten Produktstabilität und -aufreinigung etabliert werden. Die Expression eines Nanobody-HRP Fusionsproteins vereinfachte die Detektion und zeigte weiterhin ein Beispiel für die Funktionalisierung von Nanobodies. Unglücklicherweise führte dies jedoch zu verminderter extrazellulärer Nanobody Aktivität. Die Expression und unkonventionelle Sekretion eines Nanobody-basierten Antitoxins gegen Botulinum Neurotoxin A konnte zudem die Flexibilität und Anwendbarkeit der Expressionskonstrukte untermauern. Darüber hinaus wurde das potentielle Malaria Antigen PfRH5 erfolgreich sekretiert. Trotz diverser Optimierungsversuche waren Aufreinigung und Ausbeute des potentiellen Impfstoffs jedoch nicht erfolgreich, was darauf hindeutet, dass jedes Zielprotein individuelle Modifikationen des Expressionskonstrukts erfordert. Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Etablierung eines Expressionssystems ist die Optimierung der Kultivierungsbedingungen, da physiologischer Zustand und Fitness des Organismus eine zentrale Rolle für die Produktausbeute und -stabilität spielen. Die Verwendung des RAMOS Kultivierungssystems in Verbindung mit Offline-Analysen essentieller Parameter konnte hierbei einen Zusammenhang zwischen Ansäuerung des Mediums und Proteolyse des Produkts aufzeigen. Die Verwendung Protease-defizienter Stämme in Kombination mit stabilisiertem pH und optimierter Nährstoffverfügbarkeit führte daher zu einer signifikant erhöhten Ausbeute. Durch Quantifizierungen konnte eine maximale Ausbeute von mindestens 420 µg/L unkonventionell sekretiertem Protein ermittelt werden. Dies entspricht einer vierzehnfachen Steigerung im Vergleich zu vorherigen Studien. In dieser Arbeit konnten somit erhebliche Verbesserungen im Bereich Produktausbeute, -stabilität, Aufreinigung und Anwendung erreicht werden. Ferner konnten Faktoren identifiziert werden, welche zusätzliche Untersuchungen und Optimierung erfordern. Die Ergebnisse dieser Studie tragen daher substanziell zur Weiterentwicklung des U. maydis Expressionssystems hin zu einer industriell genutzten Expressionsplattform für Biopharmazeutika bei.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	26.01.2017
Dateien geändert am:	26.01.2017
Promotionsantrag am:	09.11.2016
Datum der Promotion:	12.01.2017