Dokument: Regulation of autophagy upon vaccinia virus infection

Titel:	Regulation of autophagy upon vaccinia virus infection
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40969
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170130-130942-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Khatif, Houda [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2017 / geändert 23.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Drexler, Ingo [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Vaccina Viren (VACV) sind doppelsträngige DNA Viren, die zu den Pockenviren gehören, und sich ausschließlich im Cytoplasma replizieren, in sogenannten „viral factories“. VACV werden unter anderem zur Entwicklung wichtiger Impfstoffe verwendet. Dafür eignet sich der attenuierte und replikationsdefiziente Stamm das Modifizierte Vaccinia-Virus Ankara (MVA) sehr gut, welcher auch in der Forschung als viraler Vektor eingesetzt wird. MVA ist durch zahlreiche Passagen des Ausgangsvirus Chorioallantois Vaccinia Virus Ankara auf Hühnerembryofibroblasten entstanden, in deren Verlauf sechs große Regionen im ursprünglichen Genom deletiert wurden, die unter anderem für die immunmodulatorischen Eigenschaften wie z.B. Immunevasion der Viren entscheidend sind. Diese Regionen dienen als Insertionsstellen zur Einführung fremder DNA z.B. zur Expression von Antigenen [1]. Ein umfassendes Verständnis der Wirkmechanismen dieser Viren im Umgang mit dem Wirt und der nach Infektion ausgelösten Immunantwort sollte die Identifikation neuer Zielstrukturen für immuntherapeutische Ansätze unterstützen. Während einer Infektion werden Pathogene, die in den Körper bzw. in eine Zelle eindringen, durch das Immunsystem erkannt und eine spezifische Immunantwort zu deren Bekämpfung ausgelöst. Bei der adaptiven Immunantwort spielen CD4+ T-Zellen eine entscheidende Rolle. Diese sind in der Lage fremde Antigene, die von MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse II Rezeptoren auf der Zelloberfläche präsentiert werden, zu erkennen. Peptide endogenen Ursprungs werden über Autophagie generiert. In einigen Vorarbeiten konnten wir zeigen, dass bei einer MVA Infektion von dendritischen Zellen (BMDCs) Autophagie induziert wird und über verstärkte MHC Klasse II Antigenpräsentation eine effiziente Aktivierung von CD4+ T-Zellen stattfindet. Eine Infektion durch den Wildtypstamm Western Reserve (WR) führte hingegen zu einer starken initialen Beeinträchtigung von Autophagie. Somit war das Ziel dieses Projektes zu untersuchen, wie Autophagie von VACV beeinflusst wird. Zum einen war es uns wichtig herauszufinden, wie MVA Autophagie induziert, und zum anderen, welche virale und zelluläre Faktoren für die WR-vermittelte Inhibition von Autophagie verantwortlich sind. Die Induktion bzw. Inhibition von Autophagie wurde anhand der LC3-Lipidierung unter anderem im Immunoblot nachgewiesen. Nach MVA Infektion wurde im Vergleich zu den WR-infizierten Zellen eine starke Zunahme des LC3-II Proteins beobachtet, darstellend für eine Induktion von Autophagie. Die Expression vaccinia-viraler Gene findet in einer frühen, intermediären und späten Phase statt. Es stellte sich heraus, dass die Inhibition von Autophagie durch ein früh exprimiertes Gen vermittelt wird. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Virusadsorption nicht ausreichend ist, sondern ein effizientes Eindringen des Virus in die Zelle vorausgesetzt wird. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurden 20 VACV-Gene selektiert, welche in MVA nicht vorhanden oder funktionell sind und mittels der CRISPR-Cas9 Methode WR-Deletionsmutanten für jedes einzelne Gen erzeugt. Diese Mutanten wurden auf den Verlust des inhibitorischen Effekts von VACV auf die Induktion von Autophagie in einem in dieser Arbeit etablierten Testverfahren mittels Durchflusszytometrie hin untersucht. Leider konnten wir mit den bislang getesteten Mutanten keine signifikanten Ergebnisse erzielen. Dies schließt jedoch nicht aus, dass die Deletion zweier oder mehrerer Gene gleichzeitig benötigt wird, um eine Aktivierung von Autophagie hervorzurufen. Auf molekularer Ebene konnten wir feststellen, dass die Induktion bzw. Inhibition von Autophagie, die jeweils durch MVA bzw. WR herbeigeführt wird, mit STING (Stimulator of Interferon Genes) zusammenzuhängt. Nach Erkennung doppelsträngiger DNA durch cGAS (cGAMP Synthetase) wird cGAMP (zyklisches GMP-AMP) produziert und das Adaptorprotein STING aktivert. Dies führt letztendlich zur Produktion von Typ I Interferon. In MVA infizierten STING knockout BMDCs konnte keine Hochregulation von Autophagie beobachtet werden. Zudem fand in Zellen mit normaler STING Expression ein vollständiger Abbau des Moleküls in kürzester Zeit nach MVA Infektion statt, was bei WR infizierten Zellen nicht der Fall war. Dies kann als Hinweis gewertet werden, dass STING in dem MVA-vermittelten Autophagie-induzierenden Signalweg eine wichtige Rolle spielt. Demzufolge war es von großem Interesse herauszufinden, wie und warum dieser Abbau bzw. die Hemmung des Abbaus stattfindet. Des Weiteren wurde der Autophagiesignalweg, der nach MVA Infektion in der Zelle angeschaltet wird und der von dem kanonischen Weg abweicht, näher untersucht. Vaccinia virus (VACV) is a double-stranded DNA virus that belongs to the poxvirus family, and replicates exclusively in the cytoplasm in so called viral factories. VACV are i.a. employed to establish specific vaccines. An attenuated form of VACV, the replication-deficient modified vaccinia virus Ankara (MVA), is commonly and preferentially used as a viral vector. MVA was generated through extensive passaging of the parental strain chorioallantois vaccinia virus Ankara in chicken embryo fibroblasts. Hence, the MVA genome bears six major deletions that affect genes encoding for host range and immune evasion factors, and which are used to introduce foreign antigens. Gaining deeper knowledge about how these viruses interact with the host and the immune system, should grant the opportunity to identify new targets for immunotherapeutic approaches. During an infection, invading pathogens are recognized by the immune system and a specific immune response is initiated. In regard of the adaptive immunity, CD4+ T-cells are able to recognize MHC (major histocompatibility complex) class II antigens that are presented at the cell surface. Thus, autophagy has been demonstrated to be required as an antigen provider for production of MHC class II peptides if derived from an endogenous source. In previous experiments, we were able to demonstrate MVA infection of dendritic cells (BMDCs) to cause a strong CD4+ T-cell activation after recognition of endogenous viral antigens. However, infection with the wild type strain Western Reserve (WR) significantly inhibited autophagy. Therefore, we aimed to characterize the impact of VACV infection on autophagy, and to identify the viral and cellular interaction partners that are responsible for the strain-specific activating or inhibiting effects, respectively. Autophagy induction or inhibition was tracked by analysing LC3-lipidation mainly through immunoblotting. Upon MVA infection, we observed an increase in LC3-II protein synthesis contrary to WR-infected cells, demonstrating an induction of autophagy by MVA. VACV gene expression occurs in an early, intermediate and late phase. Autophagy inhibition turned out to be an early gene mediated process, which required not only cellular adsorption but efficient virus entry. Hence, according to these observations, we selected 20 VACV genes being deleted or inactive in MVA and generated WR deletion mutants using the CRISPR-Cas9 method. We screened the deletion mutants for autophagy induction via a newly established assay based on flow cytometry. So far, we were not able to identify the inhibitory candidate gene. Still, it is possible that deletion of more than one gene is required to efficiently overcome the inhibitory effect. Further results reflected VACV autophagy interference to likely depend on Stimulator of Interferon Genes (STING). STING is a cellular adaptor molecule, which gets activated via the second messenger cGAMP (cyclic GMP-AMP), which is produced after double stranded DNA stimulation of cGAS (cGAMP synthase). STING activation will finally lead to expression of type I interferons. Interestingly, in MVA-infected STING knockout BMDCs autophagy was not triggered anymore. Additionally, STING was immediately degraded upon MVA infection in cells with regular STING expression, contrary to WR-infected cells. These outcomes emphasize the relevance of STING for MVA-mediated induction of autophagy. Thus, it was crucial to understand, how and why STING is degraded. Moreover, we tried to further characterize the autophagy pathway, which is activated after MVA infection and which strongly differs from the canonical pathway.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	30.01.2017
Dateien geändert am:	30.01.2017
Promotionsantrag am:	30.12.2016
Datum der Promotion:	17.01.2017