Dokument: Regulation and signalling of endothelial RHO GTPases
| Titel: | Regulation and signalling of endothelial RHO GTPases | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40959 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20170130-103200-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M.Sc Amin, Ehsan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Kleine GTPasen der RHO und RAS Familie sind zentrale Schalter zur zeitlichen Feinabstimmung von Signaltransduktionsprozessen. Sie regulieren somit wichtige biologische Prozesse wie Aktindynamik, Proliferation und Differenzierung. Eine abnormale Aktivierung dieser Proteine spielt vor allem eine maßgebliche Rolle bei kardiovaskulären Erkrankungen und Krebs. Die genaue Analyse der zugrunde liegenden Signalwege wird durch die Anzahl verschiedener RAS (26) und RHO (20) Proteine und ihr Zusammenspiel mit einer Vielzahl an Regulatoren (GEFs, GAPs und GDIs) und Effektoren erschwert. Um Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger Behandlungsstrategien zu gewinnen, ist es nötig, die Interaktionsnetzwerke dieser kleinen GTPasen aufzuklären. Die Untersuchung dieser Interaktionen war Ziel dieser Dissertation. Es ist gezeigt worden, dass eine RAC1- vermittelte Regulation der Plättchen-Aktivierung durch RAC1-Inhibitoren blockiert wird. In dieser Arbeit zeigen wir, dass dieser Effekt zum Teil auf einer Inhibition von PAK1, einem RAC1 Effektor, beruht. Gleichermaßen hemmt Roc-A, ein Inhibitor der RAF-Kinase nicht nur die Proliferation von Krebszellen, sondern darüber hinaus auch die Krebszellmigration und -Invasion via RHOA, RAC1 und CDC42 als Hauptregulatoren der Zellmigration. Die Wirkung von Roc-A beruht sehr wahrscheinlich auf der Inhibition von Upstream-Signalen und nicht auf der Inhibition von Rhospezifischen Regulatoren, wie GEFs, GAPs oder GDIs. P115RhoGEF, ein spezifischer GEF von RHOA, spielt eine wichtige Rolle in der endothelialen Permeabilität. Durch die Bestimmung der
Geschwindigkeitskonstanten einzelner Schritte der p115-katalysierten Nukelotidaustauschreaktion, sowie der zellulären Konzentrationen von RHOA und p115, haben wir die Dauer der RHOAAktivierung in Endothelzellen ermittelt. Trotz ihrer Schlüsselrolle bei der Regulation der endothelialen Permeabilität sind nur einige wenige der 66 RHOGAPs untersucht. Aufgrund der zahlreich vorliegenden Strukturdaten für die RHOAGAPs im humanen Proteom, haben wir deren Aktivität und Spezifität für verschiedene RHO-Proteine untersucht. Unsere Metaanalyse zeigt eine breite katalytische Effizienz von RHOGAPs für die RHO-Proteinen. Des Weiteren schlagen wir vor, dass p190RHOGAP (ein zentraler Regulator der endothelialen Permeabilität) neben RHOA auch RHOD inaktiviert. Wir beschreiben zusätzlich die direkte Inhibition der GAP-Aktivität von DLCTumorsuppressoren durch p120RASGAP. In einer weiteren Studie beschreiben wir die Spezifität von verschiedenen RAS-Effektoren, die durch ihre RAS-Assoziation- (RA-) und RAS-Bindungs- (RB-) Domänen an fünf definierte Regionen an der Oberfläche von RAS-Proteinen binden. Der RHOA-Effektor ROCK reguliert die Kontraktion vom Actomyosin durch MLCP-Phosphorylierung und -Inaktivierung, und führt somit bei einer Hyperaktivierung zu kardiovaskulären Erkrankungen, wie Vasospasmen zerebraler Gefäße und Bluthochdruck. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten ein langgestrecktes paralleles Dimer von gereinigtem volle-Länge ROCK. Diese Daten legen die Hypothese nahe, dass ROCK-Aktivität in der Zelle zusätzlich durch ScaffoldProteine moduliert wird. In einer anderen Arbeit zeigen wir, dass eine CNTF-defizienz durch MLCP-Phosphorylierung vor dem Angiotensin II-induzierten Bluthochdruck schützt. Ein anderes, wichtiges Scaffold-Protein ist NPM, welches die RAN-aktivierte Zentrosomduplikation reguliert. In einer biochemischen Studie beschreiben wir erstmalig die direkte Interaktion von NMP mit viralen Proteinen. Ein weiteres für die Aufrechterhaltung der endothelialen Barriere wichtiges Scaffold-Protein ist IQGAP1, das durch physikalische Interaktionen mit den GTP-gebundenen Formen von RAC1 und CDC42 reguliert wird. Um die Komplexität der Signaltransduktion, die durch die molekularen Schalter der RAS und RHO Familien vermittelt wird, besser zu verstehen, scheint eine detailliertere Untersuchung der Funktionen von bisher noch nicht charakterisierten Mitgliedern dieser Proteinfamilien unerlässlich zu sein.Small GTPases of RHO and RAS families tune timing of signal transduction and regulate many biological functions, such as actin dynamics, proliferation and differentiation. Their abnormal activation plays a crucial role especially in cardiovascular diseases and cancer. Strikingly, 26 human RAS and 20 RHO proteins together with numerous regulators (GEFs, GAPs and GDIs) and effectors make the study of biological pathways rather versatile. To gain new insights into disease treatment strategies, comprehensive study of the interaction networks of these GTPases is required, as aimed of the present dissertation. It has been shown that RAC1 pathway regulates platelet activation, which has been proposed to be blocked by RAC1 inhibitors. But here, we demonstrated that this effect arises partly from inhibition of PAK1, a RAC1 effector. Similarly, Roc-A, a RAF inhibitor that blocks cancer cell proliferation, also inhibits cancer cell migration and invasion by interfering with the activities of RHOA, RAC1 and CDC42, the master regulators of cellular migration. We provide evidence that these inhibitory effects may emerge from early upstream events and not from inhibition of GEFs, GAPs or GDIs. p115RhoGEF, a specific RHOA GEF, plays a critical role in increasing endothelial permeability. Measuring rate constants of all steps of p115-catalyzed nucleotide exchange reaction and the cellular concentrations of RHOA and p115 enabled us to estimate the lifetime of RHOA activation in endothelial cells. RHOGAPs play a critical role in regulation of endothelial permeability but only a few of them are studied. Existence of 66 RHOGAPs in human proteome and availability of large structural data guided us to investigate their specificities for RHO proteins. Our meta-analysis demonstrates a broad range of catalytic efficiencies of RHOGAPs towards RHO proteins. Moreover, we have proposed that p190RHOGAP, a central enhancer of endothelial barrier function, is also able to inactivate RHOD. In addition, we describe how the GAP activity of DLC tumor suppressors is physically inhibited by p120RASGAP. We have accomplished a similar study describing the binding modes of various effectors with different members of RAS family. Hence, five distinct regions determine RAS binding to RAS associating (RA) and RAS binding (RB) domains of various effectors. ROCK is a main regulator of actin-myosin contraction by phosphorylating and inactivating MLCP. Its hyper-activation leads to various cardiovascular diseases, such as cerebral vasospasm and hypertension. Using electron microscopy, we provide structural insights into an elongated parallel dimer of purified ROCK full-length. We propose that scaffold proteins may modulate ROCK autoregulation in the cellular context. Notably, we found that deficiency of CNTF, a cytokine, protects against AngII-dependent hypertension, through phosphorylation of MLCP. One of the scaffold proteins is NPM, which is known to regulate centrosome duplication triggered by RAN activation. Our biochemical data reveal for the first time direct interaction of NPM with viral proteins and may thus promote infection. Another vital scaffold protein is IQGAP1, which regulates endothelial barrier functions via physical association with GTP-bound, active RAC1 and CDC42 proteins. Here we provide insights into the mechanism of these interactions. It seems that in order to understand the complexity of signal transduction mediated through molecular switches of RAS and RHO families, the functions of their poorly characterized members needs detailed investigations. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.01.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.01.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 04.10.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.12.2016 |
