Dokument: The interaction networks of Ras proteins

Titel:	The interaction networks of Ras proteins
Weiterer Titel:	Die Interaktionsnetzwerke von Ras-Proteinen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40901
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180206-085419-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Nakhaeizadeh, Hossein [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 37,80 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2017 / geändert 13.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Proteine der Ras Familie agieren als molekulare Schalter und wechseln zwischen der aktiven, GTP- gebundenen Form und der inaktiven, GDP- gebundenen Form. Diese Moleküle erfassen extrazelluläre Signale durch die Aktivierung von Transmembranrezeptoren, und übermitteln diese Signale mittels dazwischenliegender Proteine an nachgeschaltete Zielproteine für intrazelluläre Antworten. Demzufolge spielen Ras Proteine eine erhebliche Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen, wie Genexpression, Stoffwechselprozessen, Zellzyklusprogression, Proliferation, Überleben der Zelle und Zelldifferenzierung. Im Gegensatz zu den am besten untersuchten Ras Isoformen (H-, N- und K- Ras), sind die Funktionen von anderen Isoformen, wie E- Ras oder R- Ras, bisher nicht vollständig beschrieben. E- Ras, welches ein besonderes Mitglied der Ras Familie darstellt, wird, wie wir kürzlich zeigen konnten, speziell in undifferenzierten, embryonalen Stammzellen der Maus, verschiedenen Tumorzellen, wie Magenkarzinoma und Neuroblastoma, als auch in ruhenden Sternzellen der Leber exprimiert. E- Ras verfügt oberhalb der GDP/GTP- Bindungsdomäne über eine einzigartige N- terminale Verlängerung von 38 Aminosäuren. Die Funktion dieser zusätzlichen Region mit verschiedenen Motiven war bisher unklar. Wir konnten zeigen, dass dieser einmalige N- terminale Verlängerung wesentlich für die E- Ras Signalaktivität ist, vor allem in Richtung des PI3K-AKT Signalweges. Besonders auffallend ist, dass E- Ras im Vergleich zu H- Ras ein unterschiedliches Interaktionsmuster mit nachgeschalteten Effektoren aufweist, welches mit der Abweichung der Aminosäuren in der Effektorbindungsstelle korreliert. Von all diesen Aminosäureresten ist Tryptophan 79 ausschlaggebend für die Effektorselektivität von E- Ras für PI3Ks. Eine proteomische Analyse der N- terminalen Verlängerung bei E- Ras Proteinen des Menschen und der Ratte, welche deutliche Unterschiede in der Sequenz aufweisen, führten zur Identifikation von 51 assoziierenden Proteinen (10 mit dem humanen E- Ras, 3 mit dem E- Ras der Ratte und 38 mit beiden Spezies). Diese Interaktionen ermöglichen verschiedene zelluläre Prozesse, wie Zellzyklus, Transkription, Immunantwort, Signaltransduktion, Zelladhäsion, dynamische Regulation des Zytoskellets und Stoffwechselprozesse. Eines dieser Proteine ist die zytosolische Arginase-1, welche dafür bekannt ist, L-Arginin in L-Ornithin umzuwandeln. Interaktionsstudien haben bewiesen, dass Arginase-1 verschiedene E- Ras Varianten bindet, einschließlich dem isolierten N- Terminus von E- Ras. Diese Interaktionsstudien wurden unter zellfreien Bedingungen sowohl mit aufgereinigten Proteinen, als auch mit Lysaten von Lebersternzellen durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass E- Ras die Aktivität von Arginase-1 positiv reguliert und somit eine entscheidene Rolle bei der Synthese von Polyaminen spielt. Die Gleichgewichts- Dissoziationskonstanten für die Interaktionen von H-Ras, K-Ras, N-Ras, R-Ras1 and R-Ras2 sowohl mit den Ras- Bindungsdomänen (RBD) von CRAF und PI3Kα, als auch mit den Ras- Assoziationsdomänen (RAD) von RASSF5, RALGDS und PLCε wurden jeweils mittels Fluoreszenzpolarisation bestimmt. Die gewonnen Daten zeigen unterschiedliche Effektorselektivitäten für Ras und die R-Ras Isoformen. Mittels in silico Analysen wurde eine Matrix für RAS-Effektor Interaktionen entwickelt und auf der Basis dieser fünf verschiedene Regionen definiert, wobei R1 als zentrale Erkennungsregion dient und R3 eine Determinante für Isoformspezifität darstellt. Zusätzlich konnten wir das aktuelle Model für die Interaktion zwischen Galectin-1 und H-Ras überarbeiten und zeigen, dass Galectin-1 durch die direkte Bindung von CRAF-RBD einen Komplex mit H-Ras bildet und somit ein neues Model für das Nanoclustering von H-Ras in Plasmamembranen suggerieren. Insgesamt liefern die gewonnenen Daten dieser Doktorarbeit neue Einblicke sowohl in Protein-Protein Interaktionsnetzwerke, als auch in die physische Umgebung der Ras Proteine, wodurch sich neue Perspektiven in der Erläuterung neuartiger regulierender Mechanismen der Ras Proteine, speziell in menschlichen Erkrankungen, eröffnen. Proteins of the Ras family act as molecular switches, cycling between a GTP-bound (active) and a GDP-bound (inactive) state. These molecules sense extracellular signals through activation of transmembrane receptors and intermediate proteins transduce them to downstream targets and trigger, thereby, intracellular responses. Thus, Ras proteins play a key role in various cellular processes, including gene expression, metabolism, cell cycle progression, proliferation, survival, and differentiation. Contrary to the best-investigated Ras isoforms (H-, N- and K-Ras) the individual roles of other members of the Ras family, such as E-Ras or the R-Ras isoforms, have not been fully described. E-Ras, a unique member of the Ras family, is specifically expressed in undifferentiated mouse embryonic stem cells, in several tumor cells, including gastric cancer and neuroblastoma, and also in quiescent hepatic stellate cells, as we have shown recently. E-Ras contains a unique N-terminal extension (38 amino acids) upstream of its GDP/GTP binding domain. However, the function of such an additional region with various motifs remained unclear. We found that the N-terminal extension is essential for E-Ras signaling activity, especially towards PI3K-AKT pathway. Most remarkably, E-Ras revealed a different pattern of interaction with downstream effectors as compared to H-Ras, correlating with amino acid deviations in the effector-binding site. Of all these residues, tryptophan 79 determines the effector selectivity of E-Ras for PI3Ks. A comparative proteome analysis of the N-terminal extension of human and rat E-Ras proteins, which exhibit remarkable sequence deviations, led to the identification of 51 associated proteins (10 with the human E-Ras, 3 with rat E-Ras and 38 with both species). These interactions appear to participate in distinct cellular processes, including cell cycle, transcription, immune response, signal transduction, cell adhesion, cytoskeletal dynamics and metabolism. One of these proteins is the cytosolic Arginase-1, which is known to convert L-arginine to L-ornithine. Interaction studies showed that Arginase-1 physically binds to different E-Ras variants, including isolated E-Ras N-terminus, under cell-free condition using purified proteins and also using lysates of hepatic stellate cells. E-Ras turned out to positively modulate the activity of Arginase-1 and may therefore play a role in the synthesis of polyamines. Equilibrium dissociation constants for the interaction of H-Ras, K-Ras, N-Ras, R-Ras1 and R-Ras2 with both the Ras binding (RB) domain of CRAF and PI3Kα, and the Ras association (RA) domain of RASSF5, RALGDS and PLCε, respectively, were determined using fluorescence polarization. Obtained quantitative data led to the observation of different effector selectivity for Ras and R-Ras isoforms. In combination with detailed in silico analyses we generated a matrix for RAS-effector interactions, on the basis of this interaction matrix we defined five distinct regions, with R1 being central recognition region with mainly intermolecular β-sheet contacts and R3 being a determinant for isoform specificity. Finally, we revise the current model for the interaction of galectin-1 with H-Ras. Showing that galectin-1 indirectly forms a complex with H-Ras via direct binding to CRAF-RB strongly suggests a new model for H-Ras nanoclustering in plasma membrane. Collectively, data obtained in this thesis provide new insights into protein-protein interaction networks and the physical environment of Ras proteins, and may ultimately open new perspectives in elucidating novel modulatory mechanisms of Ras proteins especially in human diseases.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	06.02.2018
Dateien geändert am:	06.02.2018
Datum der Promotion:	01.12.2016