Dokument: Kombination asymmetrischer Organo- und Biokatalyse zur Synthese chiraler 1,3-Diole

Titel:	Kombination asymmetrischer Organo- und Biokatalyse zur Synthese chiraler 1,3-Diole
Weiterer Titel:	Combination of asymmetric organo- and biocatalysis for the synthesis of chiral 1,3-diols
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40890
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170116-101536-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bulut, Dalia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 22,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.01.2017 / geändert 11.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die stereoselektive Synthese von chiralen 1,3-Diolen ist derzeit in der Organischen Chemie von besonderem Interesse, da dieses Motiv häufig als syn- oder anti-Isomer in einer Vielzahl von natürlichen Produkten zu finden ist. Aufgrund der Wichtigkeit dieser 1,3-Diole als chirale Bausteine wurden eine Vielzahl von chemischen und biokatalytischen Verfahren zur stereoselektiven Synthese von 1,3-Diolen entwickelt. In dieser Arbeit sollte eine chemoenzymatische „Tandem“-Eintopfreaktion entwickelt werden, die eine organokatalysierte Aldolreaktion zweier Ketone mit einer enzymatischen Reduktion des in situ gebildeten tertiären β-Hydroxyketons unter Ausbildung von diastereo- und enantiomerenreinen 1,3-Diolen kombiniert. Das Ziel des ersten Schwerpunktes dieser Arbeit war die Auffindung einer neuen Alkohol-Dehydrogenase, die das chirale trifluormethylierte β-Hydroxyketon (CF3-Aldol) effizient und stereoselektiv im Sinne einer kinetischen Racematspaltung (KR) zum korrespondierenden 1,3-Diol reduziert. Nach einem umfassenden Screening verschiedener mikrobieller Stämme wurden einige Hefestämme positiv für die asymmetrische Reduktion des racemischen CF3-Aldols getestet. Mittels verschiedener chromatographischer Reinigungsschritte konnte das gesuchte Zielprotein aktivitätsbasiert aus dem Rohextrakt der Hefe Pichia pastoris bis nahezu zur Homogenität angereichert und mittels MALDI-TOF MS identifiziert werden. Als Resultat wurde eine neue NADPH-abhängige Alkohol-Dehydrogenase PPADH aus P. pastoris als das CF3-Aldol-reduzierende Enzym identifiziert. Nach Klonierung und Expression wurde die neu identifizierte PPADH gereinigt und umfassend biochemisch charakterisiert. Die PPADH katalysiert bevorzugt die Reduktion aliphatischer Aldehyde und die Oxidation primärer als auch sekundärer Alkohole. Aromatische Aldehyde wie Benzaldehyd sowie β-Ketoester werden ebenfalls mit guter Aktivität reduziert. Überraschenderweise zeigte die PPADH keine vergleichbare Aktivität für andere Ketone als das CF3-Aldol. Reduktive als auch oxidative Biotransformationen von prochiralen Ketonen und racemischen Alkoholen konnten zeigen, dass die PPADH eine (S)-spezifische ADH ist. Im Genom von P. pastoris wurden fünf weitere ADHs (PPADH2-PPADH6) mit sehr hohen Sequenzähnlichkeiten zur PPADH gefunden. Diese wurden ebenfalls kloniert, exprimiert und hinsichtlich der Reduktion des CF3-Aldols getestet. Hierbei wurden bei PPADH4, die eine Sequenzähnlichkeit von 90,4 % zur PPADH1 aufwies, große Unterschiede sowohl hinsichtlich Expression, Enantio- und Diastereoselektivität als auch der kinetischen Parameter festgestellt. Durch semirationale Mutagenese auf Basis eines Aminosäuresequenz-Vergleichs als auch von Strukturdaten konnten zwei wichtige Regionen 94-96 sowie 136-142 als hot spots identifiziert werden, welche den Substrattunnel und die Position bzw. die Bindung des Substrats im aktiven Zentrum beeinflussen. Darüber hinaus, gelang es im Rahmen einer Kooperation, die Struktur der PPADH1, der PPADH4 und einiger Mutanten röntgenkristallographisch mit einer Auflösung bis zu 1,79 Å aufzuklären. Insbesondere lieferte die Kristallstruktur des ternären Komplexes mit gebundenem Cofaktor und Substrat wichtige Einblicke in den molekularen Mechanismus der PPADH. Das Ziel des zweiten Schwerpunkts dieser Arbeit war der Einsatz der PPADH für präparative Anwendungen. Hierfür wurden Ganzzellkatalysatoren konstruiert, die PPADH und die Glucose-Dehydrogenase (GDH) für die Cofaktorregenerierung beinhalten. Nach Evaluation der Reaktionsparameter konnte mit Hilfe des Ganzzellkatalysators die kinetische Racematspaltung des trifluormethylierten CF3-Aldols als auch des nicht-fluorierten Analogons (CH3 statt CF3) erfolgreich durchgeführt und die (R)-β-Hydroxyketone und die (S,S)-1,3-Diole in sehr guten Ausbeuten und hervorragenden Enantio- und Diastereoselektivitäten isoliert werden. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte die PPADH-katalysierten Racematspaltung mit der von Berkessel et al. entwickelten organokatalysierte Aldolreaktion von Trifluoracetophenon und Aceton als Tandem-Eintopfreaktion kombiniert und in Hinblick auf Nachhaltigkeit und Kompatibilität in wässrigen Milieu durchgeführt werden. Nach notwendigen Optimierungsmaßnahmen durch Veränderung der Reaktionsparameter wie beispielsweise Katalysatormenge, Reaktionszeit und Acetonmenge der Einzelreaktionen konnte eine effiziente und robuste Tandem-Eintopfreaktion in wässrigem Reaktionsmedium entwickelt werden, in der beide Reaktionsschritte simultan mit hoher Kooperativität ablaufen. Da der verwendete Singh-Katalysator in wässrigen Lösungen sehr reaktiv ist, reichen 5 mol% aus, um eine effiziente Racemisierung des (R)-Aldols über eine Retro-Aldolreaktion zu gewährleisten. In Verbindung mit der kinetischen Racematspaltung des in situ gebildeten β-Hydroxyketons mittels Ganzzellkatalysator konnte so der gesamte Prozess als dynamisch-kinetischen Racematspaltung (DKR) realisiert und das (S,S)-CF3-Diol in enantiomeren- als auch diastereomerenreiner Form isoliert werden. Bemerkenswert ist hierbei, dass aufgrund der hohen Substratspezifität der PPADH gegenüber dem in situ gebildeten β Hydroxyketon das Edukt Trifluoracetophenon nur im minimalen Umfang (<5 %) zum korrespondierenden Alkohol reduziert wird und dadurch eine simultane Reaktionsführung möglich ist. Die Anwendbarkeit der entwickelten Tandem-Eintopfreaktion konnte im präparativen Maßstab ebenfalls auf diverse para-substituierte Trifluoracetophenone als Aldolakzeptoren übertragen und die substituierten (S,S)-CF3-Diole äquivalent zum unsubstituierten CF3-Diol in optisch reiner Form erhalten werden. Die hier vorgestellte Syntheseroute stellt die bis dato erste Eintopfreaktion dar, in der die organokatalysierte Aldolreaktion und die enzymatische Reduktion simultan in Puffer als Reaktionsmedium in Form einer DKR ablaufen. Zusätzlich wurde der Zugang zu allen vier Stereoisomeren des CF3-Diols als „proof of concept“ durch Variation des Biokatalysators ((R)- oder (S)-spezifische ADH) gezeigt. Weiterhin ist es gelungen, geruchsaktive 1,3-Dioxane aus chiralen 1,3-Diolen herzustellen. The stereoselective synthesis of chiral 1,3-diols is currently of considerable interest in organic chemistry, because this motif can be found frequently in either syn and anti relationship in a large variety of natural products. Due to the importance of these chiral 1,3-diols as building blocks, a wide range of chemical and biocatalytic processes for the stereoselective synthesis of 1,3-diols have been developed. In this work, a chemoenzymatic “tandem“ one-pot synthesis was developed including an organocatalyzed aldol reaction of two ketones combined with an enzymatic reduction of the in situ formed tertiary β-hydroxy ketone to generate chiral 1,3-diols in stereochemically defined form. The aim of the first section of this thesis was the identification of a new alcohol dehydrogenase, which efficiently reduces the chiral β-hydroxy-β-trifluoromethyl ketone (CF3-aldol) to its corresponding 1,3-diol in a stereoselective manner resulting in a kinetic resolution (KR). After extensive screening of various microbial strains only a few yeast strains were positively tested for the asymmetric reduction of the racemic CF3-aldol. Finally, the desired enzyme was partially purified from the crude cell extract of wildtype Pichia pastoris strain by several chromatographic purification steps and identified by a subsequent MALDI-TOF mass spectrometric analysis. As a result, a new NADPH dependent alcohol dehydrogenase (PPADH) from P. pastoris was identified responsible for the asymmetric reduction of the CF3-aldol. After recombinant cloning and expression of the new gene coding for PPADH, the enzyme was purified and biochemically characterized. The PPADH catalyzes preferentially the reduction of aliphatic aldehydes and the oxidation of primary and secondary alcohols. Additionally, aromatic aldehydes such as benzaldehyde and β-keto esters are reduced with good activities. Surprisingly, the enzyme shows no comparable activity towards ketones other than the CF3-aldol. Reductive and oxidative biotransformations of prochiral ketones and racemic alcohols showed that the PPADH is a (S)-specific ADH. Five other ADHs (PPADH2-PPADH6) were found in the genome of P. pastoris, which showed high sequence similarities on amino acid level to the PPADH. Their coding genes were also cloned, expressed and the enzymes were tested for the reduction of the CF3-aldol. For the PPADH4, which shows a sequence similarity of 90.4 % to PPADH1, great differences were observed with regard to expression, enantio- and diastereoselectivity as well as kinetic parameters. By a semi-rational mutagenesis approach based on amino acid sequence alignment and structural data, two important regions, 94-96 and 136-142, were identified as hot spots which influence the substrate tunnel and the binding or the position of the substrate in the active site. Furthermore, the protein structures of the PPADH1, PPADH4 and some mutants were elucidated by X-ray crystallography at a resolution up to 1.79 Å by our cooperation partner. Especially, the crystal structure of PPADH as ternary complex with bound cofactor and substrate delivered important insights into the molecular mechanism of the PPADH. The aim of the second section of this thesis was the use of the PPADH for preparative applications. Therefore, different whole cell catalysts were constructed, which contain the PPADH and glucose dehydrogenase (GDH) for cofactor regeneration. After evaluation of the reaction parameters the kinetic resolutions of the trifluoromethylated CF3-aldol and its unfluorinated analogue (CH3-aldol) were successfully performed by the whole cell catalyst and the (R)-β-hydroxy ketone and the (S,S)-1,3-diols were isolated in good yields and high enantio- and diastereomeric excesses. Based on this results, the PPADH-catalyzed kinetic resolution was combined with the organocatalytic aldol reaction of trifluoroacetophenone and acetone developed by Berkessel et al. as a tandem one-pot procedure, which should be carried out in aqueous medium in terms of substainability and compatibility. After important optimization steps of the reaction parameters such as catalysts loading, reaction time and acetone amount of the individual reactions, an efficient and robust tandem one-pot reaction in aqueous buffer was developed, in which the two reaction steps took place simultaneously with high cooperativity. Due to the high reactivity of the Singh’s catalyst in aqueous solutions, only 5 mol% was sufficient for an efficient racemization of the remaining (R)-aldol through reto-aldol reaction. In combination with the kinetic resolution of the in situ formed β-hydroxy ketone by the whole cell catalyst, the entire process was implemented as a dynamic kinetic resolution (DKR) leading to the (S,S)-CF3-diol in high yield and enantio and diastereomerically pure form. Remarkably, the PPADH showed high substrate specificity towards the in situ formed β-hydroxy ketone, whereas the substrate trifluoroacetophenone was only reduced in a minimal extent (<5 %) to its corresponding alcohol facilitating a simultaneous reaction mode. The applicability of the developed tandem one-pot reaction could also be transferred on preparative scale on various para-substituted trifluoroacetophenones as aldol acceptors, so that the substituted (S,S)-CF3-diols were obtained in optically pure form as the unsubstituted CF3-diol. The presented synthetic route in this thesis represents to date the first tandem one-pot reaction, in which the organocatalyzed aldol reaction and the enzymatic reduction took place simultaneously in buffer as reaction medium via DKR. Moreover, the access to all four stereoisomers of the CF3-diol by variation of the biocatalyst ((R)- or (S)-specific ADH) has been demonstrated as a proof of concept. Furthermore, the synthesis of odour-active 1,3-dioxanes from chiral 1,3-diols was successfully achieved.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	16.01.2017
Dateien geändert am:	16.01.2017
Promotionsantrag am:	17.10.2016
Datum der Promotion:	19.12.2016