Dokument: Nucleolin: a nucleolar rna-binding protein involved in ribosome biogenesis

Titel:	Nucleolin: a nucleolar rna-binding protein involved in ribosome biogenesis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40873
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170111-105430-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Fremerey, Julia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,11 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.01.2017 / geändert 09.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Borkhardt, Arndt [Gutachter] Prof. Dr. Schwender, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In eukaryotes, ribosome biogenesis is a highly coordinated process that comprises multiple steps, including polymerase I transcription of ribosomal DNA, processing and modification of the precursor ribosomal RNA transcript, formation of mature ribosomal RNA (18S, 5.8S, 28S) and assembly of the small (40S) and large (60S) ribosomal subunits to form the mature ribosome (80S) within the cytoplasm. This important pathway requires several ribosomal proteins and ribosome biogenesis factors including RNA-binding proteins (RBPs), RNA-helicases, and endo- and exonucleases. RBPs represent 7.5% of all protein-coding genes in humans and coordinate RNA processing and post-transcriptional gene regulation. Altered expression or mutations in genes encoding ribosomal proteins, ribosome biogenesis factors or RBPs can lead to cancer and other genetic diseases. To understand the link between ribosome biogenesis and the molecular mechanisms of cancer, it is crucial to elucidate the function of RBPs that are associated with ribosome biogenesis. Nucleolin (NCL) is one of these factors, it is a multifunctional, highly abundant, nucleolar RBP, which contains four RNA recognition motifs and is implicated in ribosome biogenesis, gene expression and regulation of polymerase I transcription. High expression levels of NCL were previously observed in cancer cells. However, until today, there are no described mutations or splicing variants of NCL which are related to cancer. This thesis focuses on the characterization of the RNA-binding properties and protein-protein interactions of NCL in the context of ribosome biogenesis. In order to identify the cellular RNA targets of the RNA-binding protein NCL, photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP) as well as RNA immunoprecipitation followed by deep sequencing (RIP-Seq) were performed. Small nucleolar RNAs and precursor ribosomal RNA were identified as main targets of NCL, both of them being directly associated with ribosome biogenesis. Biochemical and structural studies revealed that NCL preferentially interacts with G/C- rich repeat sequences within the precursor ribosomal RNA. This is in concert with the nucleotide composition of the primary ribosomal RNA transcript, which contains up to 72% G and C residues. In a proteomic based approach using NCL-specific immunoprecipitation followed by mass-spectrometry analysis, 119 proteins including several ribosome biogenesis factors, ribosomal proteins of the large and the small subunit, histones, RBPs and RNA-helicases were identified. Furthermore, RNA interference experiments were conducted to further elucidate the impact of NCL on ribosome biogenesis. SiRNA mediated gene knockdown of NCL showed stable expression of mature ribosomal RNA, while precursor ribosomal RNA was slightly decreased. In summary, the transcriptome and proteome wide targets of NCL that were identified within this thesis, directly associate NCL with the highly coordinated process of ribosome biogenesis. Die ribosomale Biogenese ist ein fundamentaler und sehr komplexer Prozess, der in Eukaryoten mit der Polymerase-I-vermittelten Transkription ribosomaler DNA im Nucleolus beginnt. Das primäre ribosomale RNA-Transkript durchläuft anschließend mehrere Prozessierungs- und Modifikationsschritte und generiert die reifen ribosomalen RNAs (18S, 5.8S, 28S). Diese bilden zusammen mit weiteren Proteinkomplexen das reife Ribosom (80S), welches aus einer kleinen (40S) und großen (60) ribosomalen Untereinheiten besteht und in das Cytoplasma transportiert wird. Die Ribosomen spielen bei der Proteinbiosynthese, während der Translation der messenger RNA eine zentrale Rolle. An der Synthese von Ribosomen sind zahlreiche ribosomale Biogenese Faktoren, ribosomale Proteine, RNA-Helikasen, Endo- und Exonukleasen, sowie zahlreiche Ribonukleoproteinkomplexe und RNA-bindende Proteine beteiligt. Diese umfassen 7.5% aller Protein kodierenden Gene und spielen eine wichtige Rolle bei post-transkriptionellen Mechanismen. Mutationen in Genen, die ribosomale Proteine oder ribosomale Biogenese Faktoren sowie RNA-bindende Proteine kodieren, können Krebs und andere genetisch bedingte Krankheiten, wie z.B. Ribosomopathien, auslösen. Um den Zusammenhang zwischen den molekularen Mechanismen bei der Entstehung von Krebs und dem Prozess der ribosomalen Biogenese genauer zu verstehen, muss die Funktion von ribosomalen Biogenese Faktoren näher untersucht werden. Nucleolin ist ein nukleoläres, multifunktionales, RNA-bindendes Protein, das an der ribosomalen Biogenese, sowie an der Genexpression und Regulation der Polymerase-I Transkription beteiligt ist. Im Fokus dieser Arbeit steht die Charakterisierung der RNA-Bindestellen und die Protein-Protein Interaktionen von Nucleolin. In photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking und immunoprecipitation (PAR-CLIP) sowie RNA immunoprecipitation-sequencing (RIP-Seq) Analysen wurden small nucleolar RNAs und ribosomale Vorläufer-RNA als Targets von Nucleolin identifiziert. Um die Bindungsaffinität der identifizierten Nucleolin-RNA Komplexe näher zu bestimmen, wurden biochemische und strukturelle Untersuchungen durchgeführt. Diese weisen darauf hin, dass Nucleolin bevorzugt mit G/C-reichen Sequenzen interagiert. Dies stimmt mit der Nukleotidsequenz des primären ribosomalen RNA Transkripts überein, welches ein Target von Nucleolin ist und zu 72% aus G/C- reichen Regionen besteht. Mit Hilfe von massenspektrometrischer Analysen wurden insgesamt 119 Interaktionspartner von Nucleolin identifiziert, darunter frühe und späte ribosomale Biogenese Faktoren, ribosomale Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheit, sowie RNA-Helikasen, RNA-bindende Proteine und Histone. Um den Einfluss von Nucleolin auf die ribosomale Biogenese und auf die Expression des primären ribosomalen RNA-Transkripts näher zu untersuchen, wurden RNA-Interferenz Experimente durchgeführt. Diese zeigten eine komplette Abnahme von Nucleolin auf RNA-Ebene, eine stabile Expression reifer ribosomaler RNA und eine geringe Reduktion ribosomaler Vorläufer-RNA. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Nucleolin mit Faktoren auf Transkriptom- und Proteom- Ebene interagiert, die direkt mit der ribosomalen Biogenese assoziiert sind. Demzufolge spielt Nucleolin eine große Rolle während der rDNA Transkription, sowie in frühen und späten Prozessierungsschritten der ribosomalen Biogenese im Nukleolus.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	11.01.2017
Dateien geändert am:	11.01.2017
Promotionsantrag am:	25.04.2016
Datum der Promotion:	20.07.2016