Dokument: Auswirkungen der HCMV-Infektion auf die Entwicklung und Funktion von Natürlichen Killerzellen: Entwicklung eines in vitro Modells

Titel:	Auswirkungen der HCMV-Infektion auf die Entwicklung und Funktion von Natürlichen Killerzellen: Entwicklung eines in vitro Modells
Weiterer Titel:	Impact of the HCMV infection on Natural Killer Cell development and function: establishing an in vitro model
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40872
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170111-112105-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ising, Ricarda [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,09 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.01.2017 / geändert 09.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Uhrberg, Markus [Gutachter] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter]
Stichwörter:	HCMV, NK-Zellen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) werden dem angeborenen Immunsystem zugeordnet. Sie bilden eine Untergruppe der Lymphozyten und sind an der Immunabwehr von Virusinfektionen und Tumoren beteiligt. Zirka 15% der im peripheren Blut zirkulierenden Lymphozyten sind NK-Zellen. Darüber hinaus sind sie auch in sekundären lymphatischen Geweben angesiedelt. Ihre zytotoxische Aktivität wird über die Balance der Signale ihrer stimulierenden Rezeptoren, welche Liganden auf infizierten oder entarteten Zellen erkennen und inhibierenden Rezeptoren, die die Humanen Leukozyten Antigene-(HLA) Klasse I-Moleküle spezifisch binden, vermittelt. Überdies beeinflussen die NK-Zellen das adaptive Immunsystem indem sie Zytokine sezernieren. Das humane Zytomegalievirus (human cytomegalovirus; HCMV) ist ein β-Herpesvirus, das ein Leben lang in seinem Wirt persistiert. Dieses weit verbreitete Pathogen infiziert je nach geographischer Lage und sozioökonomischem Umfeld 30-100% der Bevölkerung. Für Gesunde ist eine Infektion in der Regel asymptomatisch, aber sie ist die häufigste infektiöse Ursache für Geburtsfehler und ein wichtiger Faktor für die Morbidität und Sterblichkeitsrate nach einer Knochenmarktransplantation. HCMV repliziert in verschiedenen Zelltypen und wird über Körperflüssigkeiten verbreitet. Um sich vor der T-Zell vermittelten Immunantwort zu schützen reduzieren mit dem HCMV infizierte Zellen die Expression der HLA-Klasse I-Moleküle. Diese Strategie macht die infizierten Zellen jedoch angreifbar gegenüber NK-Zellen. Diese detektieren das Fehlen der HLA-Klasse I-Moleküle über Vertreter zweier Rezeptorfamilien, die konservierten Killerzell-lektinähnlichen Rezeptoren (killer cell group antigen 2; NKG2) und die hochgradig polymorphen Killerzell-immunglobulinähnlichen Rezeptoren (KIR). Beide werden klonal exprimiert und kreieren ein diversifiziertes NK-Zell-Rezeptorrepertoire. Jüngste Studien belegen, dass dieses Repertoire durch eine HCMV-Infektion verändert werden kann. Einige infizierte Individuen zeigen eine klonale Expansion von NKG2C+-NK-Zellen mit gleichzeitiger Expression inhibierender KIR die spezifisch die eigenen HLA-Klasse I-Liganden binden. Darüber hinaus scheinen diese NK-Zellen einen reiferen Phänotyp zu besitzen und werden zu den NK-Gedächtniszellen (“memory” NK-Zellen) gerechnet. Während dieses Projekts lag das Interesse darin, neue Erkenntnisse über die Interaktion der NK-Zellen mit diesem klinisch höchst relevanten Pathogen zu gewinnen. Dafür wurde ein in vitro Modell etabliert um die Interaktion von sich entwickelnden NK-Zellen mit einer HCMV-infizierten Stammzellnische zu erforschen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass mesenchymale Stammzellen (mesenchymal stem cells; MSC) aus puerilem Knochenmark eine Stammzellnische bilden, die die Zelldifferenzierung zu reifen NK-Zellen unterstützt (Brands, 2014). In dieser Arbeit wurden hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (hematopoietic stem and progenitor cells; HSPC) aus Nabelschnurblut isoliert, magnetisch angereichert und anschließend auf in vitro mit dem HCMV-Stamm AD169 infizierten MSC kokultiviert. Die Kokultur mit HCMV-infizierten MSC führte zu einer signifikant beschleunigten NK-Zelldifferenzierung. Diese zeichnete sich durch einen hohen Prozentsatz NKG2A+-NK-Zellen zu einem frühen Zeitpunkt der Generierung aus. Außerdem konnten höhere Frequenzen CD16+-NK-Zellen sowie eine gesteigerte NKG2D-Expression festgestellt werden, die ebenfalls für eine beschleunigte Reifung sprechen. Umplattierungsexperimente zeigten, dass ein HCMV-infiziertes Milieu bereits in der ersten Woche der Differenzierung ausschlaggebend ist um eine gesteigerte NKG2A-Expression zwischen der zweiten bis vierten Woche auszulösen. Des Weiteren wurden drei verschiedene NK-Zellentwicklungsstadien durchflusszytometrisch sortiert und gleichfalls auf infizierten und nicht-infizierten MSC kokultiviert. Auch hier zeigte sich, dass nur HSPC, die dem Einfluss des HCMV ausgesetzt waren, eine beschleunigte Entwicklung durchliefen. Eine HCMV-Infektion scheint also vor allem für die frühe NK-Zelldifferenzierung eine entscheidende Rolle zu spielen. Es wurde außerdem untersucht, in wie weit direkter Zell-Zell-Kontakt für die beobachteten Veränderungen nötig ist. Mit Transwelleinsätzen wurden die HSPC räumlich von den infizierten MSC getrennt, während lösliche Faktoren wie Typ-I-Interferone (IFN), weiterhin ungehindert ausgetauscht werden konnten. Das Ergebnis zeigt, dass sowohl lösliche Faktoren als auch der direkte Zell-Zell-Kontakt die NKG2A-Expansion nach einer HCMV-Infektion fördern. Funktionale Assays zeigten zudem eine höhere Zytokinproduktion (IFN-γ und TNF-α) sowie eine gesteigerte zytotoxische Aktivität wenn die generierten NK-Zellen sich in der Anwesenheit des HCMV entwickelten. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein in vitro Modell für die Interaktion von sich entwickelnden NK-Zellen mit einer HCMV-infizierten Stammzellnische etabliert werden, mit dem neue Erkenntnisse über den Einfluss des HCMV auf die NK-Zellentwicklung gewonnen wurden. Natural killer (NK) cells are innate immune cells, a subpopulation of lymphocytes, defending virus infections and tumors. They comprise up to 15% of peripheral blood lymphocytes and are found in secondary lymphoid tissues as well. The NK cell cytotoxicity is mediated by a balance between signals transmitted by activating receptors, which recognize ligands on tumors and virus-infected cells and inhibitory receptors specific for human leukocyte antigens (HLA) class I molecules. Furthermore, NK cells are involved in shaping adaptive immune responses through their production of cytokines. The Human cytomegalovirus (HCMV) is a β-herpes virus that establishes a lifelong persistent infection. It is a widespread pathogen and depending on geographical location and socioeconomic factors, 50 to 100% of all humans are infected. In healthy hosts, an infection is usually asymptomatic but it represents the major infectious cause of birth defects and is an important cause of morbidity and mortality following bone marrow transplantation. HCMV replicates in different cell types and is commonly transmitted by secretion. To protect itself from T cell immune response, HCMV-infected cells downregulate classical HLA class I molecules. However, this immune evasion strategy makes the infected cells susceptible to lysis by NK cells, which recognize missing HLA class I molecules via specific cell surface receptors of two families, the conserved killer cell lectin-like receptors (killer cell group antigen 2, NKG2) and the highly polymorphic killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR). Of note, both KIR and NKG2 receptors are clonally expressed and together constitute a highly variable NK cell repertoire. Recent studies show that indeed the composition of this repertoire can be altered by HCMV infection. Some infected Individuals show clonal expansions of NKG2C+ NK cells co-expressing inhibitory KIR for self-HLA class I ligands. Furthermore it seems that these NK cells present a more mature phenotype, sometimes referred to as “memory” NK cells. During this project, gaining novel insights into the interaction of NK cells and this clinically highly relevant pathogen was the main interest. Therefore an in vitro model to investigate the interaction between developing NK cells and an HCMV-infected stem cell niche was established. It was previously elaborated that mesenchymal stem cells (MSC) from puerile bone marrow constitute a suitable human stem cells niche to promote NK cell differentiation towards mature NK cells (Brands, 2014). To this end, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) from cord blood were isolated, magnetically enriched and subsequently co-cultivated on MSC that were in vitro infected with the HCMV strain AD169. Co-culture with HCMV-infected MSC led to significantly accelerated NK cell differentiation, characterized by a high percentage of NKG2A+ NK cells at early time points. Furthermore we observed a higher frequency of CD16+ NK cells and enhanced NKG2D expression again suggestive of an accelerated NK cell differentiation process. Interestingly, in replating experiments an HCMV-infected environment was primarily important during the first week of differentiation, which was sufficient to cause considerable alterations in the NK cell repertoire of the emerging mature NK cells during weeks 2-4. Furthermore three different NK cell developmental stages were isolated by flow cytometric cell sorting and likewise co-cultured with infected and uninfected MSC, respectively. Again, only hematopoietic progenitors exposed to HCMV at the earliest stage were able to trigger accelerated NK cell differentiation, pointing towards an important role of HCMV especially at early time points of NK cell development. Moreover, we analyzed whether a direct cell-cell contact between MSC and HSPC is necessary to induce the observed developmental changes. Therefore we used transwell plates preventing direct cell contact but enabling exchange of soluble factors such as type I interferons. The result determined that soluble factors are sufficient to promote the NKG2A expansion but for a greater yield, additional cell-cell-contact is necessary. Besides, functional assays demonstrated a higher cytokine production (interferon-γ and TNF α) and cytotoxicity of NK cells developing in vitro within the presence of HCMV. In conclusion, a co-culture system for the interaction of developing NK cells and HCMV infected MSC was established and used to gain novel insight in how HCMV influences NK cell differentiation.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika (ITZ)
Dokument erstellt am:	11.01.2017
Dateien geändert am:	11.01.2017
Promotionsantrag am:	02.11.2016
Datum der Promotion:	22.12.2016