Dokument: Structure and conformational fluctuations of Phage T4 Lysozyme under native and denaturing conditions

Titel:	Structure and conformational fluctuations of Phage T4 Lysozyme under native and denaturing conditions
Weiterer Titel:	Struktur und konformationelle Fluktuationen von Lysozym aus dem T4 Phagen unter nativen und denaturierenden Bedingungen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40837
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170104-102643-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hemmen, Katherina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,38 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.01.2017 / geändert 03.01.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Seidel, Claus A. M. [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	In the presented work single-molecule and ensemble fluorescence methods were applied to the model enzyme Phage T4 Lysozyme (T4L) to characterize its behavior under native and denaturing conditions. For T4L it is known that its two subdomains undergo a hinge-bending motion while processing its substrate. We studied the dynamics of this motion by a network of FRET-pairs and related the observed transitions and conformational states to distinct steps in the enzymatic cycle. By a global analysis of 24 FRET variants, three distinct conformations were identified. Two conformations resemble known “open” and “closed” states of T4L, while the third (thermally excited state) is so far unknown. By variants, which alter the enzymatic activity of T4L, the energy landscape of the catalytic cleavage cycle was derived. With this knowledge the unfolding pathway of T4L was studied by a combined approach of CD spectroscopy and fluorescence measurements. This allowed disentangling of the unfolding steps with at least two intermediates. We find a sequential loss of structural elements and propose that the conformational equilibrium of native states plays a critical role in the unfolding of the protein, which is organized in subdomains. Fluctuation analysis covers relevant timescales from nano- to milliseconds. This allows deriving an unfolding reaction scheme, which considers fast (sub microsecond) and slow (above milliseconds) kinetics. The denatured state of T4L was studied in 7.5 M urea by a distance network. It was found that urea denatured T4L behaves like a non-ideal polymer, which showed large heterogeneity on the single-molecule level. Regions in T4L, which showed apparent residual order, were identified by building a stiffness matrix and evaluating the local side chain mobility with fluorescence anisotropy. While being well separated, we found that the individual subdomains, specifically the C-terminal subdomain, are arranged in a native-like fashion and show a rough energy landscape, as probed by fluctuation analysis. Overall, the N-terminal subdomain seems to be less stable. This results in a sequential unfolding of T4L. This might be relevant for the function, as the catalysis is related to conformational changes within the protein structure. Therefore, both protein structure and dynamics are hierarchically organized. In this work, it could be shown that the combination of several different fluorescence methods is well suited to firstly detect so far “hidden” excited, i.e. minuscule populated, states and describe fast dynamics (e.g. enzymatic cleavage under native conditions, unfolding dynamics) over more than seven orders of magnitude in time. Here, still existing gaps in the knowledge of the very well-studied model enzyme T4L could be filled – proving the outstanding potential of fluorescence in the field of structure biology where classical methods reach their limits.  In der vorliegenden Arbeit wurden Einzelmolekül- und ensemble Fluoreszenzmethoden angewandt, um das Verhalten des Modellenzyms Lysozym aus dem T4 Phagen (T4L) unter nativen und denaturierenden Bedingungen zu charakterisieren. Bei der Substratumsetzung bewegen die beiden Subdomänen von T4L sich in einer Scharnierbewegung zueinander. Wir untersuchten die Dynamik dieser Bewegung durch ein Netz von FRET-Paaren und ordneten den beobachteten Übergängen und konformativen Zuständen einzelne Schritte im enzymatischen Zyklus zu. Durch eine globale Analyse von 24 FRET-Varianten wurden drei verschiedene Konformationen identifiziert. Zwei Konformationen ähneln den bekannten "offen" und "geschlossen" Zuständen von T4L, während die dritte (ein thermisch angeregten Zustand) bisher nicht bekannt ist. Durch Varianten, die die enzymatische Aktivität von T4L beeinflussen, wurde die Energielandschaft der katalytischen Spaltung im enzymatischen Zyklus abgeleitet. Mit diesem Wissen wurde der Entfaltungspfad von T4L durch einen kombinierten Ansatz aus CD-Spektroskopie und Fluoreszenzmessungen untersucht. Dies ermöglichte die Identifizierung eines Entfaltungspfades über mindestens zwei Intermediatzustände. Wir finden einen sequentiellen Verlust von Strukturelementen und schlagen vor, dass das Konformationsgleichgewicht nativer Zustände eine entscheidende Rolle bei der Entfaltung des Proteins, das in Subdomänen organisiert ist, spielt. Fluktuationsanalyse deckt relevante Zeitskalen von Nano- bis Millisekunden ab. Dies ermöglicht die Herleitung eines Entfaltungschemas, das schnelle (sub Mikrosekunden) und langsame (über Millisekunden) Kinetiken berücksichtigt. Der denaturierte Zustand von T4L wurde in 7.5 M Harnstoff durch ein FRET-Abstandsnetzwerk untersucht. Harnstoff denaturiertes T4L verhält sich wie ein nicht-ideales Polymer, und zeigte große Heterogenität auf der Einzelmolekülebene. Regionen in T4L, die scheinbare residuelle Ordnung zeigten, wurden mittels einer Steifigkeitsmatrix identifiziert und die lokale Seitenkettenmobilität mit Fluoreszenzanisotropiemessungen ausgewertet. Während die einzelnen Subdomänen gut voneinander getrennt sind, fanden wir, dass beide, insbesondere die C-terminale Subdomäne, nativ-artig angeordnet sind und eine unebene Energielandschaft zeigen, die mittels Fluktuationsanalyse beschrieben wurde. Insgesamt scheint die N-terminale Domäne von T4L weniger stabil zu sein. Dies führt zu einer sequentiellen Entfaltung von T4L. Dies könnte für die Funktion von Bedeutung sein, da die Katalyse mit Konformationsänderungen innerhalb der Proteinstruktur in Beziehung steht. Daher sind sowohl die Proteinstruktur als auch die Dynamik hierarchisch organisiert. Insgesamt lässt sich sagen, dass die Kombination verschiedenster Fluoreszenzmethoden sehr gut geeignet ist, um Proteindynamiken zeitlich über sieben Größenordnungen zu beschreiben und wenig populierte, angeregte Zustände zu entdecken. Es konnten noch existierende Lücken in dem schon sehr gut untersuchten System T4L geschlossen werden, was das herausragende Potenzial von Fluoreszenz-basierten Methoden in der Strukturbiologie aufzeigt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie
Dokument erstellt am:	04.01.2017
Dateien geändert am:	04.01.2017
Promotionsantrag am:	03.06.2016
Datum der Promotion:	05.07.2016