Dokument: Strukturuntersuchung verschiedener Schafs-Prion Protein-Fibrillen mit biophysikalischen Methoden und Festkörper-NMR-Spektroskopie
| Titel: | Strukturuntersuchung verschiedener Schafs-Prion Protein-Fibrillen mit biophysikalischen Methoden und Festkörper-NMR-Spektroskopie | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40775 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20161221-103942-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Piechatzek, Timo [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Prion | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Fehlfaltung des Prion Proteins ist eine der Ursachen für neurodegenerative Erkrankungen im Menschen, aber auch in verschiedenen Arten der Säugetiere. Dazu zählen insbesondere Rinder (BSE), Elche (CWD) oder auch Schafe und Ziegen (Scrapie). Diese Erkrankungen sind charakterisiert durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in die fehlgefaltete Isoform PrPSc. Die Formation des PrPSc in die sog. „amyloiden Fibrillen“ ist wahrscheinlich getrieben durch den sog. „Nukleationsevent“. Exogenes PrPSc dient dabei als Keim zur Induktion des Rearrangements der PrPC Isoform in die des PrPSc. Natives PrPC polymerisiert dabei an die Enden der amyloiden Fibrillen. Aufgrund des unlöslichen Charakters und keiner Möglichkeit der Kristallisation dieser Prion-Fibrillen können hochauflösende Techniken zur strukturellen Untersuchung, wie z.B. Flüssig-NMR-Spektroskopie oder auch Röntgenkristallographie, nicht verwendet werden. Für die strukturelle Untersuchung kommen aufgrund dessen nur Techniken wie Kryo-EM und/oder Festkörper-NMR-Spektroskopie in Frage. In dieser Arbeit wurde neben biophysikalischen Methoden auch die Festkörper-NMR-Spektroskopie verwendet um die Struktur von Schafs Prion-Fibrillen zu untersuchen.
Um die strukturellen Eigenschaften der Schafs Prion-Fibrillen untersuchen zu können, wurden in dieser Arbeit verschiedene Systeme verwendet um Proben für die Festkörper-NMR-Spektroskopie herzustellen. Mit der Etablierung eines modifizierten autokatalytischen Konversionssystems sollten Prion-Fibrillen de novo hergestellt werden, die die makromorphologischen Eigenschaften natürlich vorkommender PrPSc Fibrillen besitzen. Diese sollten im Anschluss mit den bisher de novo generierten Prion-Rods verglichen werden. Der Vergleich sollte über die Eigenschaften aufklären, welche zu dem unterschiedlichen Erscheinungsbild führt, um so auch Informationen über den generellen Aufbau der Fibrillen zu erbringen. Die hier beschriebenen Ergebnisse konnten zeigen, dass die Verwendung von GdnHCl eine große Auswirkung nicht nur auf das Erscheinungsbild der Prionen, sondern auch auf die Eigenschaft der PK-Resistenz hat. So zeigten Prionen die ohne GdnHCl hergestellt wurden nicht nur das gewünschte Erscheinungsbild natürlich vorkommender PrPSc Fibrillen, sie zeigten auch, im Gegensatz zu den Prion-Rods, eine partielle PK-Resistenz. Zusammen mit den hier präsentierten Festkörper-NMR Ergebnisse konnte festgestellt werden, dass der Unterschied im Wesentlichen die Anteile der verschiedenen sekundären Strukturelemente und ihre strukturelle Packung umfasst. So betrifft der strukturelle Unterschied zumindest den Bereich zwischen Aminosäure ~102 und 124, mit einem höheren Anteil an β-Faltblatt. Diese sind weniger mobil und in einer generell weniger dichten Packung in den Prion-Rods im Vergleich zu den Prion-Fibrillen. Im weiteren Verlauf wurde neben der strukturellen Untersuchung auch auf die Frage eingegangen, ob die Prion-Fibrillen neben der Induktion neuer Fibrillen auch in der Lage sind, ihre Struktur weiter zu vererben. Mit der Verwendung von zwei verschiedenen Schafs Prion Proteinen, das eine mit den hoch infektiösen Polymorphismen M112A136R154Q171, das andere mit den nicht pathogenen T112A136R154Q171 Polymorphismen, konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Struktur nicht weitervererbt wird. Weiterhin konnte auch gezeigt werden, dass es dominante Strukturen gibt die, wenn vorhanden, keine anderen Strukturen zulassen. Die weitere Untersuchung von dreifach 2H/13C/15N markierten und Keim-induzierten ovrecPrP(MARQ) Prion-Fibrillen konnte weiteren Aufschluss über die Struktur der Prion-Fibrillen bringen. Durch diese Art der Markierung war es zum ersten Mal möglich sequentielle Informationen zu erlangen. Diese Ergebnisse konnten zeigen, dass die Prion-Fibrillen aus zwei verschieden strukturierten Einheiten aufgebaut sind, welche sich in der Länge ihre Amyloid-Kerns unterscheiden.The misfolding of the prion protein gives rise to neurodegenerative diseases not only in humans but also in several different mammals, like mad cow disease (BSE) in cattle, chronical wasting disease (CWD) in deer and elk or scrapie in sheep and goats. These diseases are characterized by a misfolding of the cellular PrPC into the disease related isoform PrPSc. The formation of the PrPSc into the amyloid fibrils is believed to be driven by a nucleation event. The rearrangement of the PrPC isoform into PrPSc is driven by Exogenous PrPSc which then leads to the polymerization formation of newly rearranged PrPSc at the ends of a fibril. Due to the fact that PrPSc amyloid fibrils are insoluble and non-crystallizable, they are not amenable to X-ray crystallography and liquid-state NMR. For structural investigations high-resolution techniques like cryo-EM or solid-state NMR-spectroscopy are necessary. In this work we used biophysical and solid-state NMR-spectroscopy to investigate the structure of different ovine prion fibrils. To investigate the structural properties of the ovine prion fibrils, different conversion systems were used to prepare prion fibrils for biophysical methods and solid-state NMR-spectroscopy. A modified autocatalytic conversion system was established to generate prion fibrils de novo which are macro morphologically related to PrPSc fibrils. Following, these prion fibrils were compared to the de novo generated prion rods. This comparison should give insight into the structural difference between the fibrils and rods. The results showed that the use of GdnHCl has a great impact onto the macro morphological appearance of the prion, Furthermore, the use of GdnHCl terminates capability of creating prion fibrils which are partially pK resistant. Prion fibrils which are de novo generated show not only the macro morphological appearance of PrPSc fibrils, they are also partially resistant against pK digestion. Together with the biophysical results, solid-state NMR-spectroscopy shows a main difference between the prion fibrils and rods in the secondary structure and their structural arrangement. The structural difference comprises the amino acid region between ~102 and 124, with a higher β-sheet content which are less mobile for the prion rods, and an overall denser structural arrangement of the prion fibrils. Following, this work involved the structural investigation of seeded prion fibrils and tried to answer the question to structural inheritance, respectively, templating event. For this purpose, two ovine prion proteins with the disease associated polymorphism M112A136R154Q171 and the disease resistant polymorphism T112A136R154Q171 were investigated leading to the conclusion that, besides the seeding, the structure cannot be inherited. Furthermore, it could be shown that there are prion structures which are dominant leading to a situation where other prion proteins can occupy only one distinct structure. Furthermore, with seeded fibrillation of the 2H/13C/15N labeled ovrecPrP(MARQ) it was for the first time possible to gain sequential information of the structure. The results show that the fibril architecture is likely to be constructed by two distinct units which have a different partial pK resistant amyloid core. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.12.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 21.12.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 04.11.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 01.12.2016 |
