Dokument: Entwicklung eines P450-basierten Ganzzellkatalysators für die selektive Oxyfunktionalisierung von α-Pinen
| Titel: | Entwicklung eines P450-basierten Ganzzellkatalysators für die selektive Oxyfunktionalisierung von α-Pinen | |||||||
| Weiterer Titel: | Development of a P450-based whole-cell catalyst for the selective oxyfunctionalization of α-pinene | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40755 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20161220-111912-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Lehmann, Sven Carsten [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Terpene sind eine vielseitige natürliche Quelle potentieller Vorstufen für Verbindungen mit chemischer oder pharmazeutischer Anwendung. Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYPs oder 450s) aktivieren molekularen Sauerstoff unter milden Bedingungen und bauen ein Sauerstoffatom in Kohlenstoffgerüste u.a. von Terpenen ein, häufig sogar selektiv. In dieser Arbeit wurden Biokatalysatoren etabliert für die selektive Hydroxylierung des Monoterpens α-Pinen zu Verbenol und die weitere Oxidation zum Keton Verbenon, welches den Geruch von Rosmarinöl prägt und eine gesuchte Verbindung für die Duft- und Aromaindustrie ist. Zuerst wurde eine kleine Bibliothek von bisher noch nicht für die selektive Hydroxylierung von (-)-α-Pinen getesteten P450-BM3-Varianten auf erhöhte Stereoselektivität durchgemustert. Dabei wurde mit ALA-328 ein Rest mit großer Wichtigkeit für die Bildung von entweder (-)-cis- oder (-)-trans-Verbenol identifiziert, obwohl die ausschließliche Bildung nur eines Diastereomers unerreicht blieb. Für seine Anwendung als Pheromon bei der Bekämpfung des Borkenkäfers könnte die Reinheit jedoch von Bedeutung sein, da die Hydroxylierung von α-Pinen im Enddarm des Borkenkäfers stereoselektiv abläuft. Kombiniert mit einer höchst stereoselektiven Alkoholdehydrogenase (ADH) konnte (-)-trans-Verbenol in einer Eintopfreaktion mit hoher Reinheit (de >99 % mit kommerziellem Enzympräparat ADH-88 der Fa.c-LEcta) gebildet werden. Ein ebenso exzellenter Überschuss wurde durch Einsatz von P450-BM3 und PpdADH1 aus Pichia pastoris GS115 für (+)-trans-Verbenol bei der Oxidation von (+)-α-Pinen erreicht. Gleichzeitig bildete die Kaskade das Keton Verbenon und die ADH bewirkte zusätzlich eine Kofaktorregeneration. Durch Zugabe eines Kosubstrats für die ADH wie 3-Oktanol, Cyclohexanol oder 2-Nonanol wurde der Umsatz bis zu 2,7-fach verbessert.
Für die Ganzzellumsetzung wurde eine Variante der P450cam (CYP101A1) mit den Mutationen Y96F/L244A/V247L/C334A, die in vitro beide α-Pinenenantiomere gleichermaßen regioselektiv zu Verbenol umsetzte (78 % (+)-Verbenol, 80 % (-)-Verbenol), mit den dazugehörigen Redoxpartnern Pdx und PdR koexprimiert. Die P. putida-Stämme DSM12264 und KT2440 sowie die E. coli-Stämme JM109 und BL21 wurden als Biokatalysatoren getestet. Zellpermeabilisierung durch Behandlung mit Polymyxin B verbesserte die Bildung von Verbenol 2- bis 4,2-fach im Falle der E. coli-Stämme und fast 19-fach für P. putida KT2440. Anders als bei den in vitro-Experimenten produzierten die Biotransformationen einen erheblichen Anteil an Verbenon (50-100 % mit nicht permeabilisierten und 15-50 % mit permeabilisierten Zellen). Koexpression der Glycerindehydrogenase GldA für die Kofaktorregeneration führte zumeist zu erhöhter Produktivität in permeabilisierten Zellen. Ein Ersetzen der GldA durch 3α-HSDH, welche Verbenol zu Verbenon oxidiert, ergab einen E. coli BL21-Ganzzellbiokatalysator, der entstehendes Verbenol fast gänzlich zu Verbenon weiter oxidiert (94 %) mit einer Produktivität von 18,7 mg/g cdw bzw. 280 mg Verbenon in 3,2 Litern.Terpenes are a diverse natural source of molecules, which may serve as precursors of further functionalized, value-added compounds for chemical or pharmaceutical application. Cytochrome P450 monooxygenases (CYPs or P450s) activate molecular oxygen under mild reaction conditions and introduce one oxygen atom to the carbon backbone of molecules such as terpenes, often even in a selective manner. In this study, biocatalysts were established for the selective hydroxylation of the abundant monoterpene α-pinene to verbenol and further oxidation to the corresponding ketone verbenone, which is an impact compound of rosemary oil and a highly desired compound in the flavor and fragrance industry. First, the poor stereoselectivity of P450-BM3 (CYP102A1) and variants thereof for hydroxylation of (-)-α-pinene to verbenol was addressed by screening a small library of not yet tested P450-BM3 variants. By this means, residue ALA-328 was identified to be of key importance for generation of either (-)-cis- or (-)-trans-verbenol, although the exclusive generation of either one of these diastereomers remained infeasible. However, for the application of verbenol as a pheromone in pest control of the bark beetle diastereomeric purity may matter as in the bark beetle’s gut hydroxylation of α-pinene occurs stereoselectively. The combination of a P450-BM3 variant with a highly stereoselective alcohol dehydrogenase (ADH) in a one-pot reaction led to high purity of (-)-trans-verbenol (de of >99 % with the commercial enzyme ADH-88 by c-LEcta). The same excellent purity was achieved by applying P450-BM3 and PpdADH1 from Pichia pastoris GS115 on (+)-α-pinene yielding (+)- trans-verbenol. But most notably, this cascade produced the ketone verbenone. Moreover, the ADH provided concomitant cofactor regeneration for the reaction. Conversion was improved up to 2.7-fold by adding 3-octanol, cyclohexanol or 2-nonanol as cosubstrates for the ADH. For whole cell conversion, P450cam (CYP101A1) variant Y96F/L244A/V247L/C334A, which in vitro converted both α-pinene enantiomers to verbenol with similar regioselectivity (78 % (+)-verbenol, 80 % (-)-verbenol), was co-expressed with the dedicated redox partners Pdx and PdR. P. putida strains DSM12264 and KT2440 were tested as whole cell biocatalysts along with the E. coli strains JM109 and BL21. Cell permeabilization by polymyxin B treatment improved the conversion to verbenol by a factor of 2 and 4.2 in case of E. coli strains and even almost 19-fold for P. putida KT2440. Unlike the in vitro experiments, biotransformations produced a considerable proportion of verbenone (50-100 % with non-permeabilized cells, 15-50 % with permeabilized cells). Co-expression of the glycerol dehydrogenase GldA for cofactor regeneration in permeabilized cells in most cases led to a further increase in productivity. By replacing GldA with the 3α-HSDH capable of converting verbenol to verbenone, an E. coli BL21 biocatalyst was created that almost entirely oxidized the intermediate verbenol to verbenone (94 %), yielding 18,7 mg/g cdw and a total of 280 mg of verbenone in 3.2 liters. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.12.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.12.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.09.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.12.2016 |
