Dokument: The role of TBC1D1 in insulin secretion from mouse pancreatic islets

Titel:	The role of TBC1D1 in insulin secretion from mouse pancreatic islets
Weiterer Titel:	Die Rolle von TBC1D1 bei der Insulinsekretion aus Langerhans-Inseln der Maus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40645
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161212-115107-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stermann, Torben [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,47 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.12.2016 / geändert 08.12.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Al-Hasani, Hadi [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Background and aims: The Rab-GTPase activating protein (RabGAP) TBC1D1 has been described for its role in both glucose and lipid metabolism in skeletal muscle. TBC1D1 is also expressed in pancreatic β-cells but its role in glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) remains to be determined. Recently TBC1D1 was shown to contribute to insulin secretion in sorted rat β-cells but with no detailed insights into a potential mechanism. To specify the role of TBC1D1 in insulin se-cretion its function in secretagogue-induced insulin secretion in isolated islets from Tbc1d1-deficient mice, transgenic mice overexpressing Tbc1d1 under the control of a RIP2 promoter and Tbc1d1/Tbc1d4-double-deficient mice, respectively was investigated. Materials and methods: Mouse pancreatic islets were isolated by ductal collagenase perfusion and subsequent pan-creas digestion. The isolated islets were applied to static and dynamic secretagogue-induced insulin secretion measurements. Whole-body glucose tolerance was measured by intraperi-toneal glucose tolerance test and dissected pancreases were used for histologic and mor-phometric analysis of islets. Isolated islets were also used for ultrastructural insulin granule determination and quantification as well as quantification of protein and gene expression in lysates by western blot and quantitative Real time PCR, respectively. Statistics were calcu-lated with appropriate tests. Results: GSIS at 25 mM glucose stimulation was substantially increased in islets from Tbc1d1-deficient mice, whereas the overexpression of Tbc1d1 had no effect on GSIS. In both cases insulin secretion at basal glucose (2 mM) was unchanged. Moreover, the additional knockout of the close TBC1D1 homologue TBC1D4 had no additive effect on GSIS compared to the single knockout of Tbc1d1. Pancreatic islets of normal C57BL/6J mice exclusively express the short variant of Tbc1d1 which was used for the generation of transgenic mice on a C57BL/6J background (RIP2-TG). Tbc1d1 mRNA in islets was predominant over Tbc1d4. TBC1D1 protein expression in RIP2-TG islets was 2.6-fold higher compared to RIP2-WT controls, whereas TBC1D1 was undetected in islets of D1KO mice. Dynamic perifusion of D1KO islets showed that the increased GSIS was attributed to both, first and second phase of insulin secretion. The Tbc1d1-related ex vivo effect on insulin secretion could not be shown in vivo. Although no differences were found in general islet morphometry between D1KO and WT mice, transmission electron microscopy revealed an increased density of both, pale and dark insulin granules in β-cells of D1KO mice after glucose stimulation. Stimulation of islets with 1 µM of the K+-ATP channel inhibitor glibenclamide with 2 mM glucose as well as 500 µM tolbutamide with 5 mM glucose, resulted in an increased insulin secretion in D1KO islets. In addition, glibenclamide potentiated GSIS at 25 mM glucose in WT islets, but not in D1KO islets. In contrast, exposure of isolated islets to 30-40 mM KCl or to 5 µM calcium ionophore A23187, respectively, had no effect on genotype-dependent insulin secretion at basal glucose levels. Protein and gene expression only showed an increase in Irs2 in D1KO islets as relevant target for insulin secretion and synthesis. Conclusion: Loss of TBC1D1 increased glucose- and sulfonylurea-induced insulin secretion in isolated islets due to increased first and second phase, but β-cell specific overexpression of the phys-iologic relevant short Tbc1d1 isoform does not. Due to potential compensatory mechanisms insulin secretion after glucose stimulation is not pronounced in D1KO mice in vivo. Loss of TBC1D1 increases glucose-induced insulin granule density in islet β-cells. The present data suggest that TBC1D1 is a novel component in the regulation of insulin secretion in mouse pancreatic β-cells and modulates insulin granule dynamics and presumably K+-ATP channel trafficking. Fragestellung: Die Rolle des Rab-GTPase aktivierenden Proteins (RabGAP) TBC1D1 wurde bereits sowohl für den Glukose- als auch den Lipidmetabolismus des Skelettmuskels beschrieben. TBC1D1 ist ebenfalls in pankreatischen β-Zellen exprimiert, seine Rolle in der glukose-stimulierten Insulinsekretion (GSIS) muss jedoch noch ermittelt werden. Kürzlich wurde gezeigt, dass TBC1D1 zur Insulinsekretion in isolierten β-Zellen der Ratte beiträgt, jedoch ohne detaillierte Einblicke in einen möglichen Mechanismus. Um die Rolle von TBC1D1 in der Insulinsekretion zu spezifizieren, wird seine Funktion im Zusammenhang mit verschiedenen sekretionsan-regenden Substanzen in isolierten Inseln untersucht. Dazu werden Inseln von Tbc1d1-defizienten Mäusen, transgenen Mäusen, die Tbc1d1 unter der Kontrolle des RIP2 Promotors exprimieren und Tbc1d1/Tbc1d4-doppel-defizienten Mäusen verwendet. Material und Methoden: Inseln der Maus wurden durch Collagenase-Perfusion des Pankreas durch den Pankreas-gang und anschließendem Verdau des Pankreas isoliert. Die Inseln wurden für die Analyse der statischen und dynamischen Insulinsekretion nach Applikation verschiedener sekretions-anregender Substanzen verwendet. Ganz-Körper Glukosetoleranz wurde durch einen intra-peritonealen Glukosetoleranztest in Mäusen ermittelt. Das präparierte Maus-Pankreas wurde für die histologische und morphometrische Analyse der Inseln verwendet sowie isolierte Inseln für die ultrastrukturelle Detektion und Quantifizierung der Insulingranula. Die zusätzliche Quantifizierung der Protein- und Genexpression mittels Western Blot und quantitativer Real time PCR wurde mit entsprechenden Lysaten isolierter Inseln durchgeführt. Die statistische Auswertung erfolgte durch angemessene Tests. Ergebnisse: Insulinsekretion nach 25 mM Glukosestimulation war in Inseln der D1KO Mäuse deutlich erhöht, während die Überexpression von Tbc1d1 keinen Einfluss auf die GSIS hatte. In bei-den Fällen war die Insulinsekretion bei 2 mM Glukose ähnlich. Darüber hinaus hatte der zu-sätzliche Verlust des TBC1D1 Homologs TBC1D4 keinen additiven Effekt auf die GSIS im Vergleich zur einzelnen Tbc1d1-Defizienz. Langerhans Inseln von normalen C57BL/6J Mäu-sen exprimieren ausschließlich die kurze Isoform von Tbc1d1, welches für die Generierung der transgenen Mäuse auf dem C57BL/6J Hintergrund (RIP2-TG) verwendet wurde. Tbc1d1 mRNA war in Inseln deutlich stärker gegenüber Tbc1d4 exprimiert. TBC1D1 wurde in den RIP2-TG Inseln 2,6-fach stärker exprimiert, als in den RIP2-WT Inseln, wohingegen TBC1D1 in D1KO Inseln nicht detektiert wurde. Die Perifusion von D1KO Inseln zeigte, dass die er-höhte GSIS auf eine Erhöhung beider Insulinsekretionsphasen zurückzuführen war. Der Tbc1d1-abhängige Effekt auf die Insulinsekretion ex vivo konnte in vivo nicht gezeigt werden. Obwohl keine Unterschiede in der generellen Inselmorphologie zwischen D1KO und WT Mäusen gefunden wurden, enthüllte die Transmissionselektronenmikroskopie eine erhöhte Dichte von sowohl blassen als auch dunklen Insulingranula in β-Zellen der D1KO Inseln nach Stimulation mit Glukose. Stimulation isolierter Inseln mit sowohl 1 µM des K+-ATP Kanal-Inhibitors Glibenclamid bei 2 mM Glukose, als auch 500 µM Tolbutamid bei 5 mM Glukose, führte zu einer erhöhten Insulinsekretion in D1KO Inseln. Zusätzlich potenzierte Glibenclamid die GSIS mit 25 mM zwar in WT Inseln, jedoch nicht in D1KO Inseln. Im Gegensatz dazu wurde die Insulinsekretion bei basalen Glukosekonzentrationen weder durch 30-40 mM KCl, noch durch 5 µM des Kalzium-Ionophors A23187 genotyp-spezifisch verändert. Die Protein- und Genexpression einer Vielzahl von Genen, zeigte nur bei Irs2 als relevantes Gen für In-sulinsekretion und –synthese eine erhöhte Expression in D1KO Inseln. Schlussfolgerungen: Der Ausfall von TBC1D1 verändert die Glukose- und Sulfonylharnstoff-induzierte Insulinsek-retion in isolierten Inseln durch die Erhöhung beider Insulinsekretionsphasen. Die β-Zell spe-zifische Überexpression der physiologisch relevanten kurzen Tbc1d1 Isoform hat dagegen keinen Effekt auf die GSIS. Aufgrund potentieller Kompensationsmechanismen ist die erhöh-te Insulinsekretion nach Glukosestimulation in D1KO Mäusen nicht ausgeprägt. Der Ausfall von TBC1D1 erhöht die glukose-induzierte Insulingranuladichte in β-Zellen. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass TBC1D1 ein neuer Bestandteil in der Regulation der Insulin-sekretion der Mausinsel ist und die Dynamik der Insulingranula und möglicherweise die Translokation von K+-ATP-Kanälen moduliert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Deutsches Diabetes-Zentrum
Dokument erstellt am:	12.12.2016
Dateien geändert am:	12.12.2016
Promotionsantrag am:	09.09.2016
Datum der Promotion:	28.11.2016