Dokument: Modifikationen und Interaktionen des Transkriptionsfaktors Grainyhead-like 3 im kardiovaskulären System

Titel:	Modifikationen und Interaktionen des Transkriptionsfaktors Grainyhead-like 3 im kardiovaskulären System
Weiterer Titel:	Modifications and interactions of the transcription factor grainyhead-like 3 in the vascular system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40633
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161207-091921-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kohlgrüber, Stefanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,54 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.12.2016 / geändert 06.12.2016
Beitragende:	Dr Altschmied, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Stichwörter:	Grainyhead-like 3, Transcription factors, Phosphorylation, Interaction
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der Transkriptionsfaktor Grainyhead-like 3 (GRHL3) spielt eine essentielle Rolle im humanen Endothel indem er Migration, Apoptose von Endothelzellen sowie die Aktivität der endothelialen NO-Synthase reguliert. Allerdings sind die Mechanismen, die an der Regulation der Aktivität dieses Proteins beteiligt sind, weitgehend unbekannt. Transkriptionsfaktoren können durch post-translationale Modifikationen wie z. B. Phosphorylierung, aber auch durch die Interaktionen mit anderen Proteinen reguliert werden. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die Phosphorylierung von GRHL3 zu untersuchen, über die in Säugern bisher nichts bekannt war. Um das endogene Protein analysieren zu können, wurde zunächst ein neuer Antikörper gegen GRHL3 etabliert. Nachfolgend konnte zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass GRHL3 sowohl an Threonin-, als auch an Tyrosinresten phosphoryliert wird. Eine weitere Charakterisierung der Tyrosinphosphorylierung zeigte, dass es sich um eine NO-induzierte Src-Kinase-abhängige Phosphorylierung handelt. Detailliertere Untersuchungen zeigten, das die Tyrosinreste an den Positionen 64, 171 und 335 entweder für diese Phosphorylierung nicht relevant sind oder möglicherweise mehrere dieser Reste gleichzeitig Src-abhängig oder durch andere Tyrosinkinasen phosphoryliert werden. Aus der NO-Abhängigkeit der GRHL3-Phosphorylierung ergab sich als ein weiteres Ziel dieser Arbeit die GRHL3-Expression in Abhängigkeit eines NO-regulierenden Stimulus mit pathophysiologischer Bedeutung zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von primären humanen Endothelzellen mit LDL und Fruktose die Protein-Menge von GRHL3 reduziert. Dieses Ergebnis wurde in einem Mausmodell validiert, in dem gezeigt wurde, dass eine Hochfett-Diät die Expression von GRHL3 im Aorten-Endothel verringert. Im Rahmen dieser in vivo Versuche wurde zudem erstmals eine Expression von GRHL3 in glatten Muskelzellen der Gefäßwand nachgewiesen, die ex vivo sowohl auf RNA-, als auch auf Protein-Ebene validiert wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden zudem bisher unbekannte, potentielle Interaktionspartner von GRHL3 über eine Ko-Immunpräzipitation und eine nachfolgende massenspektrometrische Analyse identifiziert. In Zukunft sollen die Relevanz der Phosphorylierungen von GRHL3, seiner Wechselwirkungen mit den verschiedenen Interaktionspartner für die Endothelfunktion sowie seine Rolle in glatten Muskelzellen untersucht werden um damit ein umfangreicheres Bild der Rolle dieses Transkriptionsfaktors in der Physiologie und Pathophysiologie der Gefäßwand zu erhalten. The transcription factor grainyhead-like 3 (GRHL3) plays an essential role in the human endothelium by regulating migration and apoptosis of endothelial cells as well as the activity of the endothelial NO-synthase. However, the mechanisms involved in the regulation of the activity of this protein, are largely unknown. Transcription factors are known to be regulated by post-translational modifications, e.g. phosphorylation, but also by interactions with other proteins. Therefore, one of the aims of this work was to analyze the phosphorylation of GRHL3 as nothing was known about this modification in mammalians. Initially, a new GRHL3 antibody was established, to be able to analyze the endogenous protein. Subsequently, it was demonstrated for the first time that GRHL3 is phosphorylated on threonine as well as on tyrosine residues. Further characterization showed that the tyrosine phosphorylation is NO-inducible and Src-kinase dependent. Detailed studies revealed that the tyrosines in position 64, 171 and 335 are not relevant for this phosphorylation. Alternatively, several of them could be simultaneously phosphorylated by Src-kinases or they could target for other tyrosine kinases. Based on the NO-inducible phosphorylation of GRHL3, a second aim was the analysis of GRHL3 expression in dependence on an NO-regulating stimulus with pathophysiological relevance. It could be shown that treatment with LDL and fructose reduces GRHL3 protein levels in endothelial cells. This was corroborated in a mouse model, in which a high fat diet reduced the expression of GRHL3 in the aortic endothelium. Within the context of these experiments it was demonstrated for the first time that GRHL3 is also expressed in vascular smooth muscle cells, which was validated ex vivo on the RNA and protein level. Furthermore, in the present work so far unknown, potential interaction partners of GRHL3 were identified by co-immunoprecipitation and subsequent mass spectrometric analysis. In the future, the impact of GRHL3 phosphorylation and of its interactions with the different proteins on endothelial function as well as its role in smooth muscle cells will be examined to get a more comprehensive picture of the functions of this transcription factor in the physiology and pathophysiology of the vascular wall.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	07.12.2016
Dateien geändert am:	07.12.2016
Promotionsantrag am:	23.09.2016
Datum der Promotion:	26.10.2016