Dokument: Signaltransduktion von Interleukin-23, Interaktionen der intrazellulären Domäne des humanen IL-23 Rezeptors
| Titel: | Signaltransduktion von Interleukin-23, Interaktionen der intrazellulären Domäne des humanen IL-23 Rezeptors | |||||||
| Weiterer Titel: | Signal transduction of interleukin-23, Interaction of the intracellular domain of the human IL-23 receptor | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40600 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20161208-114243-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Mrotzek, Simone [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Scheller, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Scheu, Stefanie [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Interleukin-23 (IL-23) ist ein heterodimeres Zytokin, bestehend aus den Untereinheiten p19 und p40. Das Protein p40 ist auch Bestandteil von Interleukin-12 und beide Zytokine zählen zur Interleukin-6 Familie. IL-23 ist vor allem für die Differenzierung und Stabili- sierung von T-Helferzellen 17 (TH17) verantwortlich, welche durch die Produktion des pro-inflammatorischen Zytokins IL-17 charakterisiert sind. Verschiedene Studien zeigen, dass die IL-23-TH17-IL-17-Achse bei der Entstehung von Autoimmun- und chronisch entzündlichen Erkrankungen eine wichtige Rolle spielt.
Wie genau die Signaltransduktion über IL-23 funktioniert, ist noch weitgehend unbekannt. Sie verläuft über ein Heterodimer aus dem IL-12 Rezeptor β1 (IL-12Rβ1) und dem Zytokin- eigenen IL-23 Rezeptor (IL-23R). Der IL-23R besitzt in der intrazellulären Domäne sieben Tyrosinreste, die mögliche Phosphorylierungsstellen für den JAK-STAT-Signalweg sind. Vermutet wird, dass vor allem STAT3 bei der Signaltransduktion von IL-23 von Bedeutung ist. Ziel der Arbeit war herauszufinden, welche Tyrosinreste im humanen IL-23R für die STAT3-Phosphorylierung verantwortlich sind. Außerdem sollte die Beteiligung anderer Signalwege untersucht werden. Dafür wurde zunächst eine Chimäre des IL-23R kloniert, bestehend aus der murinen extrazellulären (ECD) und transmembranen Domäne (TM), sowie der humanen intrazellulären Domäne (ICD). Mittels PCR wurden verschiedene Mutations- und Deletionsvarianten dieser intrazellulären Domäne erzeugt. Die verschie- denen Varianten des chimären IL-23 Rezeptors wurden zusammen mit dem murinen IL-12Rβ1 in HeLa Zellen transfiziert und stabil in Ba/F3-gp130 Zellen transduziert. Durch FACS-Analyse und Kontrolle der mRNA-Expression wurde überprüft, dass die Rezeptoren auf den Ba/F3 Zellen korrekt vorhanden waren. Anschließend wurden die Zellen mit murinem Hyper-IL-23 (mHIL-23) stimuliert. Zelllysate wurden hergestellt und die Aktivierung von STAT3 durch Western Blot analysiert. Überraschenderweise wies die Variante, in denen alle für eine STAT3-Phosphorylierung in Frage kommenden Tyrosine zu Phenylalanin mutiert wurden (Y397/463/484/611F), noch ein Phospho-STAT3-Signal auf. Die Deletionsvarianten, bei denen die ICD des chimären IL-23R C-terminal des Tyrosins 463 entfernt wurde, zeigten hingegen sowohl in HeLa als auch in Ba/F3-gp130 Zellen keine STAT3-Phoyphorylierung mehr. Der Tyrosinrest 463 spielt somit keine Rolle bei der STAT3-Phosphorylierung. Diesen Ergebnissen zufolge gibt es neben den Tyrosinen im C-terminalen Teil des humanen IL-23R noch ein weiteres Bindemotiv für STAT3-Phosphorylierung. Dies stimmt mit den Untersuchungen zum murinen IL-23R überein. Durch die Generierung weiterer Deletionsvarianten des mIL-23R konnte der Bereich eingeengt werden (Aminosäuren 554-624). Die Aminosäuresequenz vom murinen und humanen IL-23 Rezeptor stimmt in diesem Bereich weitgehend überein. Die Suche nach Interaktionspartnern und die weitere Einengung über Deletionen in diesem Bereich sollen in Zukunft weiteren Aufschluss über die Signalweiterleitung des IL-23R über STAT3-Phosphorylierung geben. Die Proliferationsanalysen zeigen, dass über den ersten Tyrosinrest 397 andere Signalwege als der JAK-STAT-Weg beteiligt sind. Dabei könnte es sich um den MAP-Kinase-Weg handeln. Auch ein Einfluss über PI3K und NFκB wäre denkbar und soll zukünftig weiter untersucht werden.Interleukin-23 is a heterodimeric cytokine consisting of the subunits p19 and p40. Protein p40 is also part of Interleukin-12 and both cytokines are members of the IL-6 family. The main function of IL-23 is the differentiation and stabilisation of T helper cells 17 (TH17), which are characterized by their production of the pro-inflammatory cytokine IL-17. Multiple studies show that the IL-23-TH17-IL-17-axis plays an important role in the development of autoimmune- and chronic inflammatory diseases. It remains largely unclear how the signal transduction via IL-23 is functioning. A heterodi- mer consisting of the IL-12 receptor β1 (IL-12Rβ1) and the cytokine-specific IL-23 receptor (IL-23R) is needed. The IL-23R features seven tyrosine residues in the intracellular domain (ICD), which are possible sites of phosphorylation for the JAK-STAT-pathway. It is conceived that STAT3 plays a major role in the signal transduction of IL-23. The main objective of this thesis was to uncover which tyrosine residues in the hu- man IL-23R are responsible for the STAT3-phosphorylation. Additionally, it was of interest to examine the involvement of other signalling pathways. For this purpose a chimera of the IL-23R was cloned, consisting of the murine extracellular and transmembrane domain, as well as the human intracellular domain. Using PCR, different mutation and deletion variants of this intracellular domain were generated. The different variants of the chimeric IL-23R together with the murine IL-12Rβ1 were transfected in HeLa cells and stably transduced in Ba/F3-gp130 cells. Using FACS-analysis and control of the mRNA-expression, it was verified that the receptors on the Ba/F3-cells were existent in correct manner. Afterwards the cells were stimulated with murine hyper-IL-23 (mHIL-23). Cell lysates were prepared and Western-Blotting allowed analysis of STAT3-activation. Notably, even the variant in which all tyrosines that are eligible for a STAT3-phosphorylation were mutated to phenylalanine (Y397/463/484/611F) showed a phospho-STAT3-signal. Deletion variants in which the ICD of the chimeric IL-23R was removed C-terminal from tyrosine 463 showed no STAT3-phosphorylation anymore in both HeLa- as well as Ba/F3-gp130 cells. Thus, the tyrosine residue 463 plays no role for phosphorylation of STAT3. According to these results, there is another binding motive for STAT3-phosphorylation aside from the tyrosines in the C-terminal part of the human IL-23R. This is in accordance with results for the murine IL-23R. Through generation of additional deletion variants of the mIL-23R, the area of the binding motive could be narrowed down to between amino acids 554-624. The amino acid sequence of the murine and human IL-23R in this area is almost identical. The search for interaction partners and identification of binding motives through deletions in this area will give further insight into the signaling pathways of the IL-23R over STAT3-phosphorylation. The proliferation analyses showed that there is a participation of other signaling pathways aside from the JAK-STAT-pathway via the first tyrosine residue 397, which could possibly be MAP-Kinase pathway. Equally, the influence over PI3K and NFκB will be examined in further detail. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.12.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.12.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.09.2015 | |||||||
| Datum der Promotion: | 23.11.2016 |
