Dokument: Atomic force microscopy and spectroscopy analysis of membrane protein stability and conformation in cellular bilayer mimics

Titel:	Atomic force microscopy and spectroscopy analysis of membrane protein stability and conformation in cellular bilayer mimics
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=40530
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20161129-095411-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Bronder, Anna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,57 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.11.2016 / geändert 26.11.2016
Beitragende:	Prof. Dr. med. Häussinger, Dieter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	AFM, membrane proteins, amyloid beta, force spectroscopy
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Ziel dieser Arbeit war die Studie der verschiedenen Membran-assoziierten Proteine Aβ1-42, BR und TGR5 mit AFM. Zwei der untersuchten Proteine wurden ausgewählt auf Grund ihrer medizinischen Relevanz, während eins, BR, als Model-Protein benutzt wurde. Die Untersuchung dieser Proteine in ganzen Zellen auf Einzel-Molekül Ebene zur Aufklärung ihrer Struktur und möglicher struktureller Änderungen auf Grund von Fehlfaltungsprozessen ist schwierig. Aus diesem Grund werden Membran-nachahmende Modelle benötigt. Zwei spezifisch entworfene Membran-nachahmende Modelle wurden in dieser Arbeit entwickelt. Das erste Modell ist eine sBLM, eine Membran aus einer Lipid Doppelschicht, hergestellt auf Mica, welche hauptsächlich aus Phospholipiden und Cholesterin besteht. Der Effekt von Aβ1-42 auf diese Modell-sBLM wurde hier gezeigt. Es kann geschlussfolgert werden, dass nur die Oligomer-Spezies von Aβ1-42 einen sichtbaren Effekt auf die Membran hat. Abbildungen mit AFM haben gezeigt, dass sich Aβ1-42 Oligomere in die sBLM bei Raumtemperatur integrieren und bei physiologischen Temperaturen von 37 °C zu einer Dissoziation der sBLM von der Oberfläche führen. sBLMs ohne Cholesterinanteil zeigten keine Integration von Aβ1-42 Oligomeren und waren stabil bei 37 °C. Flotation Dichtegradienten Zentrifugations-Experimente ließen erkennen, dass Aβ1-42 Oligomere entweder lipidassoziiert bleiben nach der Dissoziation der Membran, oder zu größeren Oligomeren und Fibrillen weiter aggregieren. Aβ1-42 Phasenübergangs-Experimente mit CF befüllten Vesikeln der gleichen Komposition wie sBLMs, lassen darauf schließen, dass Oligomere keinen Effekt auf die Stabilität von diesen Vesikeln haben. Das zweite Modell ist eine tBLM. Die hier entwickelte tBLM ist eine Membran, welche partiell durch ein kovalent gebundenes Lipid an die Quarzglas Oberfläche verankert ist. Mit BR als ein Modellprotein wurde die Anwendbarkeit dieses Systems für kraftspektroskopische Messungen bestätigt. Die Quarzglas Oberfläche wurde zunächst funktionalisiert durch Silanisierung, Anbinden eines PEG Spacers und das zeitgleiche Anbinden eines Protein- und Lipidankers. Der Erfolg der Funktionalisierungsschritte wurde bestätigt durch XPS, AFM und Kraftspektroskopie. Das Anbinden von BR über einen His6-tag/trisNTA Komplex wurde gezeigt durch die spezifische Elution von BR von der Oberfläche. Nach der Rekonstitution von BR auf der Oberfläche in der tBLM wurde dies ebenfalls durch einen einzigen Satz BR spezifischer Kraftkurven deutlich. Diese Kraftkurven zeigten weiterhin die zur Dissoziation eines His6-tag/trisNTA Komplexes benötigte Kraft im letzten Abriss. Dieser Abriss repräsentiert die Kraft, welche benötigt wird, um den letzten Teil des Proteins aus der Membran zu ziehen. Um die hier Beschriebene tBLM in Studien an medizinisch relevanten Proteinen einsetzen zu können, wurde die Sequenz des GPCR TGR5 in den pIVEX2.3d Vektor integriert, was das Protein für CFE zugänglich macht. The aim of this work was to study the different membrane associated proteins Aβ1-42, BR and TGR5 with AFM. Two of the investigated proteins have been chosen due to their relevance in medical research, while one, BR, was used as a model protein. Studying these proteins on a single molecule level in whole cells to gain knowledge about their structure and possible structural changes due to misfolding is challenging. Therefore, the use of artificial membrane mimicking systems is needed. Two specifically designed membrane mimicking systems have been created in this work. The first system is a sBLM, a bilayer lipid membrane formed on mica consisting mainly of phospholipids and cholesterol. The effect of Aβ1-42 on the model sBLM has been demonstrated here. It can be concluded that only the oligomeric species of Aβ1-42 has an observable effect on the membrane. AFM imaging showed that Aβ1-42 oligomers integrate into the sBLM at RT and lead to a dissociation of the sBLM from the solid support at physiological temperatures of 37 °C. sBLMs without a cholesterol component show no incorporation of Aβ1-42 oligomers and were stable at 37°C. Floatation density gradient experiments revealed that Aβ1-42 oligomers either remain associated with lipids after membrane dissociation or aggregate further into larger oligomers and fibrils. Aβ1-42 oligomers show no effect on the stability of vesicles with the same composition as the sBLM, as shown in phase transition experiments of CF containing vesicles. The second system is a tBLM, which is partially bound to a quartz glass substrate through a covalently linked lipid. With BR as a model protein the applicability of this system for force spectroscopic measurements was verified. The quartz glass surface was first functionalized using silanization, binding of a PEG spacer and simultaneous binding of a protein and lipid anchor. Success of functionalization steps was verified by XPS, AFM and force spectroscopy. Binding of BR through a His6-tag/trisNTA complex was shown first through the specific elution of BR from the surface. After reconstituting BR onto the surface inside the tBLM, the specific orientation was also indicated by a single set of BR specific force curves. These curves additionally showed the dissociation forces of a His6-tag/trisNTA complex in the last peak. This peak is representative for the force needed to pull the remaining protein from the membrane. To be able to implement the here described tBLM in the study of a medically relevant protein, the sequence of the GPCR TGR5 was integrated into the pIVEX2.3d vector, which makes the protein available for CFE.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.11.2016
Dateien geändert am:	29.11.2016
Promotionsantrag am:	11.12.2015
Datum der Promotion:	19.01.2016